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技术服务 >CRISPR/Cas9服务 >Cas9基因敲除(敲入)全套服务
Cas9基因敲除(敲入)全套服务

预实验:

1.  Cas9导入细胞方法:尝试各种方法,如脂质体类转染、电转、慢病毒感染、腺病毒感染等,确定高效导入Cas9方法。

2.   药物浓度预实验:降低后续阳性克隆筛选和检测工作难度。

3.  单克隆培养情况:观察细胞是否可以单克隆培养。

基因敲除(敲入):

1.    靶点设计

一般在不同转录产物的共同外显子上设计3个靶点,靶点位置尽量在基因CDS的前1/3ATG之后,最好能破坏重要的domain和所有的转录产物isoform。第一批合成构建3个,效果不佳或时间紧张的可一次构建6个。

2.   载体构建和病毒包装

根据预实验结果,选择合适的普通载体或病毒载体,吉满生物现拥有3类载体:普通Cas9载体、慢病毒Cas9载体和腺病毒Cas9载体。

3.   内源活性筛选

转染细胞或感染细胞48H后,使用PuroBlasticidin筛选48H,提取基因组DNA。使用T7E1酶验证打靶载体的活性。将有效的突变型PCR产物测序验证。

4.   Donor载体(基因敲入)

根据筛选的gRNA靶点位置,构建Donor普通载体或腺病毒载体。共转染/感染 Cas9-gRNADonor.

5.   单克隆筛选

无限稀释到每孔1个细胞的数量,每株细胞铺至少296孔板。细胞长好够,验证内源活性并送测。

6.   获得突变型

如需纯合子,则可能需要重复步骤3-5

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CRISPR/Cas9基因敲除试剂盒

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