腺相关病毒(Adeno-Associated Viral Vector,AAV)属于微小病毒科 (parvovirus),为无包膜的单链线状DNA病毒。AAV的基因组约4700bp,包括上下游两个开放读码框架(ORF),位于分别由145个核苷酸组成的2个反向末端重复序列(ITR)之间。由于腺相关病毒具有宿主范围广、安全性高、免疫原性低、表达稳定和物理性质稳定等优点,已被广泛地应用于基础研究和临床试验中,并且腺相关病毒载体已成为世界上最常用的基因治疗载体之一。
腺相关病毒需要辅助病毒如腺病毒、单纯疱疹病毒存在的条件下,才能在感染的宿主细胞中复制合成装配蛋白,产生新的病毒颗粒。野生型AAV感染人宿主细胞后,可定点整合到19号染色体19q13.3qter处,该区域AAVS1可能与ITR和Rep蛋白的作用相关。
与腺病毒相比,腺相关病毒免疫原性较低,有多种血清型,可感染不同组织的细胞。AAV2是目前应用最广的腺相关病毒,对多数常见细胞均有较好效果。AAV-2是天然缺陷型病毒(生产性感染依赖于几个额外的反式因子),并且目前还没有发现它和任何的人类疾病有关联。在吉满生物使用的AAV Helper-Free System中,AAV-2 反向重复(ITR)序列和rep/cap基因分别位于缺少共同序列的单独的质粒上,以阻止生产出重组野生型病毒。
AAV Helper-Free System利用已经明确用于调节AAV复制和表达的腺病毒基因产物,并且这些基因产物能通过转染引进宿主细胞。在AAV
Helper-Free System中,生产具感染性的AAV病毒颗粒所需的腺病毒基因产物(例如:E2A,E4和VA RNA 基因)大部分由pHelper质粒提供,其余的腺病毒基因产物由稳定表达腺病毒E1基因的AAV-293宿主细胞提供。本系统包括通过改良HEK293腺相关病毒生产能力而衍生出的AAV-293细胞。通过消除对活的辅助病毒的需求,AAV Helper-Free
System提供一个更安全,更纯净和更便利的替代逆转录病毒和腺病毒的基因传递系统。
技术服务:
腺相关病毒包装流程:

服务优势:
1. 宿主细胞范围广:腺相关病毒可以感染广泛的哺乳动物细胞,重组腺相关病毒能感染分裂期和非分裂期细胞;
2. 滴度高:可以生产出≥1E12vg/ml的高滴度病毒;
3. 表达出的蛋白质可以正确的折叠和修饰;
4. 表达稳定:长期的基因表达潜能;
5. 多种血清型 :AAV1,AAV2,AAV5,AAV6,AAV7,AAV8,AAV8-2M,AAV9,DJ,DJ/8,Rh10,PHP.S ,PHP.eB;
6. 免疫原性低:AAV2的基因组仅4681个核苷酸,便于用常规的重组DNA技术,进行动物实验时造成的免疫反应小;
7. 安全性高:迄今从未发现野生型AAV对人体致病,重组AAV基因组序列上去除了大部分的野生型AAV基因组元件,进一步保证了安全性;
应用实例:

Journal of Neuro-Oncology(2017). [IF=2.98]. Epigenetically controlled Six3
expression regulates glioblastoma cell proliferation and invasion alongside
modulating the activation levels of WNT pathway members.
[1] Prasad K M R, Xu Y, Yang Z, et al. Robust cardiomyocyte-specific gene expression following systemic injection of AAV: in vivo gene delivery follows a Poisson distribution[J]. Gene therapy, 2011, 18(1): 43.
[2] Inagaki K, Fuess S, Storm T A, et al. Robust Systemic Transduction with AAV9 Vectors in Mice: Efficient Global Cardiac Gene Transfer Superior to That of AAV8[J]. Molecular Therapy, 2006, 14(1):45.
[3] Vandendriessche T, Thorrez L, Acosta‐Sanchez A, et al. Efficacy and safety of adeno‐associated viral vectors based on serotype 8 and 9 vs. Lentiviral vectors for hemophilia B gene therapy[J]. Journal of Thrombosis and Haemostasis, 2007, 5(1): 16-24.
[4]Ayers JI, Fromholt S, Sinyavskaya O, et al.Widespread and Efficient Transduction of Spinal Cord and Brain Following Neonatal AAV Injection and Potential Disease Modifying Effect in ALS Mice[J].Mol Ther. 2015 Jan;23(1):53-62
[5]Chadderton N, Millington-Ward S, Palfi A, et al. Improved retinal function in a mouse model of dominant retinitis pigmentosa following AAV-delivered gene therapy[J]. Molecular Therapy, 2009, 17(4): 593-599.
附表1.可供选择的载体;
附表2.不同血清型AAV的组织嗜亲性;
附表3.不同AAV血清型对相同的组织和细胞具有不同的感染效率;
附表4.各种病毒的特点;
附表1.可供选择的载体:
编号
|
载体类型
|
载体用途
|
载体元件
|
PGMAAV-4895
|
腺相关病毒
|
过表达
|
GPAAV-CAG(CAGGSA)-MCS-WPRE
|
PGMAAV-4901
|
腺相关病毒
|
过表达
|
GPAAV-CaMKIIa-MCS-mCherry-WPRE
|
PGMAAV-4862
|
腺相关病毒
|
过表达
|
GPAAV-CaMKIIa-MCS-WPRE
|
PGMAAV-4892
|
腺相关病毒
|
过表达
|
GPAAV-CMV-MCS-3×Flag-T2A-eGFP-WPRE
|
PGMAAV-4890
|
腺相关病毒
|
过表达
|
GPAAV-CMV-MCS-3×Flag-T2A-mCherry-WPRE
|
PGMAAV-4869
|
腺相关病毒
|
过表达
|
GPAAV-CMV-MCS-3×Flag-WPRE
|
PGMAAV-4866
|
腺相关病毒
|
过表达
|
GPAAV-CMV-MCS-eGFP-3Flag-WPRE
|
PGMAAV-4878
|
腺相关病毒
|
过表达
|
GPAAV-CMV-MCS-WPRE
|
PGMAAV-4891
|
腺相关病毒
|
过表达
|
GPAAV-EF1a-eGFP-MCS-WPRE
|
PGMAAV-4889
|
腺相关病毒
|
过表达
|
GPAAV-EF1a-MCS-WPRE
|
PGMAAV-4896
|
腺相关病毒
|
过表达
|
GPAAV-GFAP-MCS-WPRE
|
PGMAAV-4894
|
腺相关病毒
|
过表达
|
GPAAV-hSyn-eGFP-MCS-WPRE
|
PGMAAV-4907
|
腺相关病毒
|
过表达
|
GPAAV-hSyn-MCS-mCherry-WPRE
|
PGMAAV-4864
|
腺相关病毒
|
过表达
|
GPAAV-hSyn-MCS-WPRE
|
PGMAAV-PA0
|
腺相关病毒
|
过表达
|
PGMAAV-CMV-intron-MCS
|
PGMAAV-MA2
|
腺相关病毒
|
过表达/miRNA过表达
|
GPAAV-CMV-mCherry-MCS-WPRE
|
PGMAAV-MA1
|
腺相关病毒
|
过表达/miRNA过表达
|
GPAAV-CMV-eGFP-MCS-WPRE
|
PGMAAV-SB1
|
腺相关病毒
|
RNAi
|
PGMAAV-CMV-intron-ZsGreen1-hU6-MCS
|
PGMAAV-4381
|
腺相关病毒
|
RNAi
|
PGMAAV-CMV-intron-mCherry-hU6-MCS
|
附表2.不同血清型AAV的组织嗜亲性:
吉满生物在包装腺相关病毒时有多种不同的AAV血清型可供客户选择,建议客户针对不同组织器官选择相应血清型的AAV病毒,见下表。

附表3.不同AAV血清型对相同的组织和细胞具有不同的感染效率:
Cell Line
|
AAV-1
|
AAV-2
|
AAV-3
|
AAV-4
|
AAV-5
|
AAV-6
|
AAV-8
|
AAV-9
|
AAV-DJ
|
AAV-DJ/8
|
Huh-7
|
13
|
100
|
2.5
|
0.0
|
0.1
|
10
|
0.7
|
0.0
|
500
|
0.2
|
HEK293
|
25
|
100
|
2.5
|
0.1
|
0.1
|
5
|
0.7
|
0.1
|
500
|
0.3
|
HeLa
|
3
|
100
|
2.0
|
0.1
|
6.7
|
1
|
0.2
|
0.1
|
667
|
0.2
|
HepG2
|
3
|
100
|
16.7
|
0.3
|
1.7
|
5
|
0.3
|
ND
|
1250
|
0.5
|
Hep1A
|
20
|
100
|
0.2
|
1.0
|
0.1
|
1
|
0.2
|
0.0
|
400
|
0.1
|
911
|
17
|
100
|
11
|
0.2
|
0.1
|
17
|
0.1
|
ND
|
500
|
0.0
|
CHO
|
100
|
100
|
14
|
1.4
|
333
|
50
|
10
|
1.0
|
25000
|
5.0
|
COS
|
33
|
100
|
33
|
3.3
|
5.0
|
14
|
2.0
|
0.5
|
500
|
0.3
|
MeWo
|
10
|
100
|
20
|
0.3
|
6.7
|
10
|
1.0
|
0.2
|
2857
|
1.0
|
NIH3T3
|
10
|
100
|
2.9
|
2.9
|
0.3
|
10
|
0.3
|
ND
|
500
|
0.1
|
A549
|
14
|
100
|
20
|
ND
|
0.5
|
10
|
0.5
|
0.1
|
1000
|
0.1
|
HT1180
|
20
|
100
|
10
|
0.1
|
0.3
|
33
|
0.5
|
0.1
|
333
|
0.2
|
Monocytes
|
1111
|
100
|
ND
|
ND
|
125
|
1429
|
ND
|
ND
|
100
|
ND
|
Immature DC
|
2500
|
100
|
ND
|
ND
|
222
|
2857
|
ND
|
ND
|
200
|
ND
|
Mature DC
|
2222
|
100
|
ND
|
ND
|
333
|
3333
|
ND
|
ND
|
100
|
ND
|
AAV-2 作为标准,感染效率为 100. ND =未检测
[1]Grimm D, Lee J S, Wang L, et al. In vitro and in vivo
gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of
adeno-associated viruses [J]. Journal of virology, 2008, 82(12): 5887-5911.
附表4.各种病毒的特点:
病毒表达系统
|
腺病毒表达系统
|
慢病毒表达系统
|
腺相关病毒系统
|
病毒基因组
|
双链DNA病毒
|
RNA病毒
|
单链DNA病毒
|
是否整合
|
病毒基因组游离于宿主基因组外,瞬时表达外源基因
|
病毒基因组整合于宿主基因组,长时间、稳定表达外源基因
|
低频整合
|
感染细胞类型
|
感染分裂和不分裂细胞
|
感染分裂和不分裂细胞
|
分裂和非分裂细胞
|
表达丰度
|
高水平表达
|
高水平表达
|
高水平表达
|
表达时间
|
快(1-2 天)
|
慢(2-4 天)
|
快(1-2 天)
|
滴度
|
滴度高达1E12pfu/ml
|
最高可达1E9-10TU/ml
|
最高可达1E9-13TU/ml
|
克隆容量
|
可插入高达8kb的外源片段,滴度随插入片段长度增加而降低
|
可插入不超过8kb的外源片段,滴度随插入片段长度增加而降低
|
可插入不超过3 kb外源DNA片段,滴度随插入片段长度增加而降低
|
免疫原性
|
高免疫原性
|
低免疫原性
|
低免疫原性
|
动物模型
|
不能得到转基因动物
|
可产生转基因动物,效率达50以上
|
可产生转基因动物
|
启动子
|
可以更换特异性启动子
|
可以更换特异性启动子
|
可以更换特异性启动子
|
能否用于MIRCORNA
|
可以
|
可以
|
可以
|
能否用于四环素诱导
|
不可以
|
TET-ON,TET-OFF
|
TET-ON,TET-OFF
|
其它相关产品:
Ø 现货光遗传AAV腺相关病毒
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