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技术分享 | 基因干扰研究工具(下)
吉满生物
2024-10-08

背景介绍


RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象,其机制是通过阻碍特定基因的转录或翻译来抑制基因表达。


由于RNAi具有高度的序列专一性,可以特异地沉默基因,从而获得基因功能丧失或基因表达量的降低。



(图片来源:RNA Therapeutics Institute)



上篇为大家介绍了siRNA、shRNA两种常用的基因干扰工具,详情可点击基因干扰研究工具(上)查看,今天就继续为大家介绍基因干扰相关的特色服务,一起往下看吧~


组织特异性干扰: miR30-shRNA


表达shRNA常用的polⅢ型启动子有U6和H1,由于构建序列较短,shRNA能够轻易的插入病毒载体,但是想实现特定组织中的基因沉默,少不了组织特异性启动子的助力,然而U6和H1并不具有组织特异性。


基于miRNA骨架的shRNA干扰载体,采用了pol II型启动子(包括多种组织特异性启动子)驱动,从而实现特定组织中的基因沉默。目前用于干扰作用的miRNA骨架(如miR30、miR155、miR17-92等)中,最常用的就是miR30结构。


载体优势

一、启动子选择性多


基于mir30的shRNA可以通过RNA聚合酶II启动子转录,包括CMV、CAG、诱导型启动子和组织特异性启动子等,尤其是组织特异性启动子,在这类启动子的作用下,利用miR30结构实现的基因敲低往往只限于某些特定的组织或器官,同时表现出发育调节等特性。


二、多个shRNA共表达


RNA聚合酶II能够有效转录长RNA,因此可以通过多顺反子结构将多个shRNA构建至同一个启动子下,缩减载体长度的同时可以实现对多个基因的RNA干扰。


三、报告基因共表达


通过多顺反子结构将shRNA与报告基因在同一启动子下表达,能更精确地监测shRNA的转录水平。


四、作用稳定且高效


基于miR30结构的shRNA不太容易通过干扰内源性miRNA途径引起细胞毒性;miR30的天然环状结构能确保精确的Dicer切割并减少脱靶效应。


吉满生物可以为客户提供多种特异性启动子,能够实现不同组织/细胞的特异性表达。可以将选定启动子和shRNA序列构建至mir30-shRNA载体上,并能提供序列筛选服务,助力筛选出干扰效果更好的shRNA(mir-30),此外,我们还可进行后续慢病毒(点击了解产品)、腺相关病毒(点击了解产品)的包装,实现组织特异性基因沉默!


Tet-On诱导性干扰


Tet调控表达系统通过诱导药物(如四环素和强力霉素等)改变调控蛋白的构象,从而达到调控目标蛋白表达的目的。TetR(Tet阻遏蛋白,Tet repressor protein)与TetO(Tet操纵子,Tet operator),能够特异性结合。


当无诱导药物存在时,TetR会与TetO结合,从而阻断下游耐药基因的表达;当有诱导药物存在时,TetR的构象会发生改变,并从TetO上脱离下来,使下游耐药基因得以表达。


Tet-on系统组成


调节表达载体

反应表达载体

PhCMV(人巨细胞病毒早期启动子)

TRE(Tet应答元件,Tet-responsive element)

rtTA(反义Tet转录活化因子,reverse tetracycline transcriptional activator):rTetR(反义TetR,reverse TetR)和单纯疱疹病毒(HSV)VP16 蛋白C端的一段转录激活区域融合而成。

PminCMV(CMV启动子,minimal CMV promoter)

目的基因组成


Tet-on原理


rtTA是由tTA突变4个氨基酸形成,它的表型与tTA相反。生理条件下,rtTA与TRE不结合,由于PminCMV缺少增强子,因此目的基因不表达;

给于DOX后,DOX与rtTA的结合体与TRE结合,从而启动基因表达。


吉满生物为客户提供tet-on干扰慢病毒包装以及细胞株构建服务。


CRISPRi(基因抑制/沉默)


CRISPRi(CRISPR Interference)系统是在CRISPR/Cas9 的基础上发展而来的,可特异性地抑制靶基因的转录而并非将基因knockout来实现调控。相比于knockout,CRISPRi 能够在不同水平对靶基因进行剂量控制的敲减,是用于抑制内源性基因转录的强大工具。


当dCas9(没有切割活性的Cas9)被引导到靶基因的转录起始位点TSS(transcription start site)时,dCas9能够物理性阻碍RNA聚合酶的通过,导致基因沉默。同时dCas9融合了一个基因抑制结构域,如KRAB结构域,这样的蛋白称之为dCas9-KRAB,可以进一步提高转录抑制的效率。此外,dCas9也可以融合双抑制结构域KRAB-MeCP2,抑制效果更佳。


由于dCas9-KRAB CRISPRi系统是在DNA水平抑制基因表达,因此适用于多种类型的基因,包括:mRNA、非编码RNA、反义转录本、核定位RNA以及聚合酶III 转录本等基因的转录抑制等。


技术优势


不改变内源基因组背景、介导的敲低是可诱导且可逆、基因抑制效果可筛选、适用更多基因种类。


服务流程




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吉满生物
2024-10-08

背景介绍


RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象,其机制是通过阻碍特定基因的转录或翻译来抑制基因表达。


由于RNAi具有高度的序列专一性,可以特异地沉默基因,从而获得基因功能丧失或基因表达量的降低。



(图片来源:RNA Therapeutics Institute)



上篇为大家介绍了siRNA、shRNA两种常用的基因干扰工具,详情可点击基因干扰研究工具(上)查看,今天就继续为大家介绍基因干扰相关的特色服务,一起往下看吧~


组织特异性干扰: miR30-shRNA


表达shRNA常用的polⅢ型启动子有U6和H1,由于构建序列较短,shRNA能够轻易的插入病毒载体,但是想实现特定组织中的基因沉默,少不了组织特异性启动子的助力,然而U6和H1并不具有组织特异性。


基于miRNA骨架的shRNA干扰载体,采用了pol II型启动子(包括多种组织特异性启动子)驱动,从而实现特定组织中的基因沉默。目前用于干扰作用的miRNA骨架(如miR30、miR155、miR17-92等)中,最常用的就是miR30结构。


载体优势

一、启动子选择性多


基于mir30的shRNA可以通过RNA聚合酶II启动子转录,包括CMV、CAG、诱导型启动子和组织特异性启动子等,尤其是组织特异性启动子,在这类启动子的作用下,利用miR30结构实现的基因敲低往往只限于某些特定的组织或器官,同时表现出发育调节等特性。


二、多个shRNA共表达


RNA聚合酶II能够有效转录长RNA,因此可以通过多顺反子结构将多个shRNA构建至同一个启动子下,缩减载体长度的同时可以实现对多个基因的RNA干扰。


三、报告基因共表达


通过多顺反子结构将shRNA与报告基因在同一启动子下表达,能更精确地监测shRNA的转录水平。


四、作用稳定且高效


基于miR30结构的shRNA不太容易通过干扰内源性miRNA途径引起细胞毒性;miR30的天然环状结构能确保精确的Dicer切割并减少脱靶效应。


吉满生物可以为客户提供多种特异性启动子,能够实现不同组织/细胞的特异性表达。可以将选定启动子和shRNA序列构建至mir30-shRNA载体上,并能提供序列筛选服务,助力筛选出干扰效果更好的shRNA(mir-30),此外,我们还可进行后续慢病毒(点击了解产品)、腺相关病毒(点击了解产品)的包装,实现组织特异性基因沉默!


Tet-On诱导性干扰


Tet调控表达系统通过诱导药物(如四环素和强力霉素等)改变调控蛋白的构象,从而达到调控目标蛋白表达的目的。TetR(Tet阻遏蛋白,Tet repressor protein)与TetO(Tet操纵子,Tet operator),能够特异性结合。


当无诱导药物存在时,TetR会与TetO结合,从而阻断下游耐药基因的表达;当有诱导药物存在时,TetR的构象会发生改变,并从TetO上脱离下来,使下游耐药基因得以表达。


Tet-on系统组成


调节表达载体

反应表达载体

PhCMV(人巨细胞病毒早期启动子)

TRE(Tet应答元件,Tet-responsive element)

rtTA(反义Tet转录活化因子,reverse tetracycline transcriptional activator):rTetR(反义TetR,reverse TetR)和单纯疱疹病毒(HSV)VP16 蛋白C端的一段转录激活区域融合而成。

PminCMV(CMV启动子,minimal CMV promoter)

目的基因组成


Tet-on原理


rtTA是由tTA突变4个氨基酸形成,它的表型与tTA相反。生理条件下,rtTA与TRE不结合,由于PminCMV缺少增强子,因此目的基因不表达;

给于DOX后,DOX与rtTA的结合体与TRE结合,从而启动基因表达。


吉满生物为客户提供tet-on干扰慢病毒包装以及细胞株构建服务。


CRISPRi(基因抑制/沉默)


CRISPRi(CRISPR Interference)系统是在CRISPR/Cas9 的基础上发展而来的,可特异性地抑制靶基因的转录而并非将基因knockout来实现调控。相比于knockout,CRISPRi 能够在不同水平对靶基因进行剂量控制的敲减,是用于抑制内源性基因转录的强大工具。


当dCas9(没有切割活性的Cas9)被引导到靶基因的转录起始位点TSS(transcription start site)时,dCas9能够物理性阻碍RNA聚合酶的通过,导致基因沉默。同时dCas9融合了一个基因抑制结构域,如KRAB结构域,这样的蛋白称之为dCas9-KRAB,可以进一步提高转录抑制的效率。此外,dCas9也可以融合双抑制结构域KRAB-MeCP2,抑制效果更佳。


由于dCas9-KRAB CRISPRi系统是在DNA水平抑制基因表达,因此适用于多种类型的基因,包括:mRNA、非编码RNA、反义转录本、核定位RNA以及聚合酶III 转录本等基因的转录抑制等。


技术优势


不改变内源基因组背景、介导的敲低是可诱导且可逆、基因抑制效果可筛选、适用更多基因种类。


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