背景介绍
基因过表达(gene overexpression)是将目的基因编码区序列(CDS)克隆到相应的质粒或病毒载体上,利用载体骨架上构建的调控元件,使基因可以在人为的控制条件下实现大量转录和翻译,从而实现目的基因的过表达。此外,还可以选择报告基因进行示踪或抗性基因进行筛选。
基因过表达研究应用
常用的基因表达载体有质粒载体和病毒载体,病毒载体又包括:腺相关病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和逆转录病毒载体等,广泛应用于体外和体内基因功能研究。
上篇为大家介绍了质粒载体、慢病毒载体、腺相关病毒载体三类基因过表达工具,详情可点击基因过表达工具介绍(上)查看,今天继续为大家介绍其他三种工具,一起往下看吧~
【吉满生物】基因过表达工具介绍(下)
四、PiggyBac转座载体
PiggyBac属于II类转座子,通过“剪切-粘贴”机制移动,即从基因组一个位置转座到另一个位置,不留下序列本身(与I类启动子通过“复制-粘贴”的移动方式不同),是目前转基因研究中应用最广泛的工具之一。
PiggyBac转座子可利用质粒转染(非病毒转导)把感兴趣的基因长期稳定地整合到靶细胞基因组。具有安全、高效、负载容量大的优点,且相对于一般载体,其插入位点为TTAA,因此具有比较高的特异性。piggyBac转座系统不仅可作为哺乳动物及培养细胞的转基因工具,也是一种潜在的非病毒类基因治疗载体。
PiggyBac系统包含两个载体:一个载体被称为辅助质粒,负责编码转座酶;另一个载体被称为转座子质粒,包含两个末端重复序列(TRs)以及两者之间的被转座区域。
载体特点
①安全性高、操作方便(可直接用质粒转染细胞)
②体载容量大(10kb-20kb),可实现多基因的共表达
③转基因可长期稳定地表达,通过调节转座子质粒和辅助质粒的比例,提高外源基因的整合效率
④易于确定整合位点,通过反向PCR精确确定目的基因插入的位置
⑤不同类型细胞转染效率差异较大
吉满服务
吉满生物的PiggyBac转座子载体与辅助质粒经过优化后,可在大肠杆菌中高拷贝复制。该载体系统对多种类型的靶细胞均具有高效的转导效率,实现外源基因的高水平表达。
五、Tet-On诱导表达慢病毒载体
Tet-On诱导表达系统是调控目的基因定时表达的强大工具,Tet-On诱导表达载体在没有四环素或其他类似物(doxycycline)存在时,目的基因几乎不表达;当添加四环素/Dox时,目的基因得以快速高水平表达。Tet-on表达调控系统是当前应用更为广泛的四环素调控系统!
载体特点
①精准调控:Tet-On表达载体可严格调控基因的表达,药物剂量及用药时间可控,在没有诱导剂的情况下可将背景泄露最小化,并保持该系统对四环素诱导的高灵敏度;
②表达量高:TRE启动子可驱动GOI在诱导状态下高水平表达;
③安全性好:四环素及其衍生物应用多年,安全可靠;低剂量即可获得良好的效果。
吉满服务
吉满生物能为客户提供Tet-on表达调控载体,并能根据客户需要包装成Tet-On慢病毒。
六、CRISPRa(转录激活)
CRISPR-Cas9系统是目前被广泛运用的基因编辑系统,其原理是由sgRNA介导Cas9核酸酶靶向目标序列,对序列进行切割。Cas9核酸酶剪切活性取决于两个结构域:RuvC和HNH。当这两个结构域同时处于失活状态时,Cas9将不具有核酸酶活性,成为dCas9(dead Cas9)。
CRISPRa(基因激活)系统是用于激活内源性基因转录的强大工具,切割失活的dCas9连上转录激活因子(如VP64、p65和HSF1),可以有效促进基因组特定位点的转录。研究表明,三种基于CRISPR-dCas9的转录激活系统(VPR, SAM和SunTag)在动物细胞中也能提高目的基因表达,并且效果更好,应用更广泛。
载体特点
①操作简易:仅需dCas9核酸酶、sgRNA和转录激活因子(如VP64),即可调控目的基因的转录水平;
②调控可逆:与常规转基因技术相比,不需导入外源DNA,不会永久性的修饰基因组DNA;
③强烈激活:转录激活的基因通常得到非常高水平的表达;
④适用广谱:无物种限制、无细胞种类限制。
吉满服务流程