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技术分享 | 吉满生物提供一系列基因过表达研究工具(下)
吉满生物
2024-10-08

背景介绍


基因过表达(gene overexpression)是将目的基因编码区序列(CDS)克隆到相应的质粒或病毒载体上,利用载体骨架上构建的调控元件,使基因可以在人为的控制条件下实现大量转录和翻译,从而实现目的基因的过表达。此外,还可以选择报告基因进行示踪或抗性基因进行筛选。


基因过表达研究应用


常用的基因表达载体有质粒载体和病毒载体,病毒载体又包括:腺相关病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和逆转录病毒载体等,广泛应用于体外和体内基因功能研究。


上篇为大家介绍了质粒载体、慢病毒载体、腺相关病毒载体三类基因过表达工具,详情可点击基因过表达工具介绍(上)查看,今天继续为大家介绍其他三种工具,一起往下看吧~


【吉满生物】基因过表达工具介绍(下)


四、PiggyBac转座载体


PiggyBac属于II类转座子,通过“剪切-粘贴”机制移动,即从基因组一个位置转座到另一个位置,不留下序列本身(与I类启动子通过“复制-粘贴”的移动方式不同),是目前转基因研究中应用最广泛的工具之一。


PiggyBac转座子可利用质粒转染(非病毒转导)把感兴趣的基因长期稳定地整合到靶细胞基因组。具有安全、高效、负载容量大的优点,且相对于一般载体,其插入位点为TTAA,因此具有比较高的特异性。piggyBac转座系统不仅可作为哺乳动物及培养细胞的转基因工具,也是一种潜在的非病毒类基因治疗载体。


PiggyBac系统包含两个载体:一个载体被称为辅助质粒,负责编码转座酶;另一个载体被称为转座子质粒,包含两个末端重复序列(TRs)以及两者之间的被转座区域。


载体特点


①安全性高、操作方便(可直接用质粒转染细胞)

②体载容量大(10kb-20kb),可实现多基因的共表达

③转基因可长期稳定地表达,通过调节转座子质粒和辅助质粒的比例,提高外源基因的整合效率

④易于确定整合位点,通过反向PCR精确确定目的基因插入的位置

⑤不同类型细胞转染效率差异较大


吉满服务



吉满生物的PiggyBac转座子载体与辅助质粒经过优化后,可在大肠杆菌中高拷贝复制。该载体系统对多种类型的靶细胞均具有高效的转导效率,实现外源基因的高水平表达。


五、Tet-On诱导表达慢病毒载体


Tet-On诱导表达系统是调控目的基因定时表达的强大工具,Tet-On诱导表达载体在没有四环素或其他类似物(doxycycline)存在时,目的基因几乎不表达;当添加四环素/Dox时,目的基因得以快速高水平表达。Tet-on表达调控系统是当前应用更为广泛的四环素调控系统!


载体特点


精准调控:Tet-On表达载体可严格调控基因的表达,药物剂量及用药时间可控,在没有诱导剂的情况下可将背景泄露最小化,并保持该系统对四环素诱导的高灵敏度;

表达量高:TRE启动子可驱动GOI在诱导状态下高水平表达;

安全性好:四环素及其衍生物应用多年,安全可靠;低剂量即可获得良好的效果。


吉满服务


吉满生物能为客户提供Tet-on表达调控载体,并能根据客户需要包装成Tet-On慢病毒。


六、CRISPRa(转录激活)


CRISPR-Cas9系统是目前被广泛运用的基因编辑系统,其原理是由sgRNA介导Cas9核酸酶靶向目标序列,对序列进行切割。Cas9核酸酶剪切活性取决于两个结构域:RuvC和HNH。当这两个结构域同时处于失活状态时,Cas9将不具有核酸酶活性,成为dCas9(dead Cas9)。


CRISPRa(基因激活)系统是用于激活内源性基因转录的强大工具,切割失活的dCas9连上转录激活因子(如VP64、p65和HSF1),可以有效促进基因组特定位点的转录。研究表明,三种基于CRISPR-dCas9的转录激活系统(VPR, SAM和SunTag)在动物细胞中也能提高目的基因表达,并且效果更好,应用更广泛。


载体特点


操作简易:仅需dCas9核酸酶、sgRNA和转录激活因子(如VP64),即可调控目的基因的转录水平;

调控可逆:与常规转基因技术相比,不需导入外源DNA,不会永久性的修饰基因组DNA;

强烈激活:转录激活的基因通常得到非常高水平的表达;

适用广谱:无物种限制、无细胞种类限制。


吉满服务流程



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吉满生物
2024-10-08

背景介绍


基因过表达(gene overexpression)是将目的基因编码区序列(CDS)克隆到相应的质粒或病毒载体上,利用载体骨架上构建的调控元件,使基因可以在人为的控制条件下实现大量转录和翻译,从而实现目的基因的过表达。此外,还可以选择报告基因进行示踪或抗性基因进行筛选。


基因过表达研究应用


常用的基因表达载体有质粒载体和病毒载体,病毒载体又包括:腺相关病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和逆转录病毒载体等,广泛应用于体外和体内基因功能研究。


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【吉满生物】基因过表达工具介绍(下)


四、PiggyBac转座载体


PiggyBac属于II类转座子,通过“剪切-粘贴”机制移动,即从基因组一个位置转座到另一个位置,不留下序列本身(与I类启动子通过“复制-粘贴”的移动方式不同),是目前转基因研究中应用最广泛的工具之一。


PiggyBac转座子可利用质粒转染(非病毒转导)把感兴趣的基因长期稳定地整合到靶细胞基因组。具有安全、高效、负载容量大的优点,且相对于一般载体,其插入位点为TTAA,因此具有比较高的特异性。piggyBac转座系统不仅可作为哺乳动物及培养细胞的转基因工具,也是一种潜在的非病毒类基因治疗载体。


PiggyBac系统包含两个载体:一个载体被称为辅助质粒,负责编码转座酶;另一个载体被称为转座子质粒,包含两个末端重复序列(TRs)以及两者之间的被转座区域。


载体特点


①安全性高、操作方便(可直接用质粒转染细胞)

②体载容量大(10kb-20kb),可实现多基因的共表达

③转基因可长期稳定地表达,通过调节转座子质粒和辅助质粒的比例,提高外源基因的整合效率

④易于确定整合位点,通过反向PCR精确确定目的基因插入的位置

⑤不同类型细胞转染效率差异较大


吉满服务



吉满生物的PiggyBac转座子载体与辅助质粒经过优化后,可在大肠杆菌中高拷贝复制。该载体系统对多种类型的靶细胞均具有高效的转导效率,实现外源基因的高水平表达。


五、Tet-On诱导表达慢病毒载体


Tet-On诱导表达系统是调控目的基因定时表达的强大工具,Tet-On诱导表达载体在没有四环素或其他类似物(doxycycline)存在时,目的基因几乎不表达;当添加四环素/Dox时,目的基因得以快速高水平表达。Tet-on表达调控系统是当前应用更为广泛的四环素调控系统!


载体特点


精准调控:Tet-On表达载体可严格调控基因的表达,药物剂量及用药时间可控,在没有诱导剂的情况下可将背景泄露最小化,并保持该系统对四环素诱导的高灵敏度;

表达量高:TRE启动子可驱动GOI在诱导状态下高水平表达;

安全性好:四环素及其衍生物应用多年,安全可靠;低剂量即可获得良好的效果。


吉满服务


吉满生物能为客户提供Tet-on表达调控载体,并能根据客户需要包装成Tet-On慢病毒。


六、CRISPRa(转录激活)


CRISPR-Cas9系统是目前被广泛运用的基因编辑系统,其原理是由sgRNA介导Cas9核酸酶靶向目标序列,对序列进行切割。Cas9核酸酶剪切活性取决于两个结构域:RuvC和HNH。当这两个结构域同时处于失活状态时,Cas9将不具有核酸酶活性,成为dCas9(dead Cas9)。


CRISPRa(基因激活)系统是用于激活内源性基因转录的强大工具,切割失活的dCas9连上转录激活因子(如VP64、p65和HSF1),可以有效促进基因组特定位点的转录。研究表明,三种基于CRISPR-dCas9的转录激活系统(VPR, SAM和SunTag)在动物细胞中也能提高目的基因表达,并且效果更好,应用更广泛。


载体特点


操作简易:仅需dCas9核酸酶、sgRNA和转录激活因子(如VP64),即可调控目的基因的转录水平;

调控可逆:与常规转基因技术相比,不需导入外源DNA,不会永久性的修饰基因组DNA;

强烈激活:转录激活的基因通常得到非常高水平的表达;

适用广谱:无物种限制、无细胞种类限制。


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