实验干货
神经系统疾病是全球致残的主要原因和第二大死亡原因，包括神经功能性和退行性疾病，如帕金森病 (Parkinson's disease, PD)、阿尔兹海默症 (Alzheimer disease, AD)、脊髓性肌萎缩症 (Spinal muscular atrophy, SMA)、肌萎缩侧索硬化症 (Amyotrophic lateral sclerosis, ALS)等。
由于神经系统细胞类型的高度异质性（如神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞）以及血脑屏障（Blood-brain barrier，BBB）这一特殊结构的存在，传统研究方法在探索特定神经细胞功能、解析发病机制和开发有效治疗策略时面临诸多挑战。
腺相关病毒（Adeno-associated virus, AAV）载体因其安全性高、免疫原性低、能够实现外源基因在特定细胞类型中长期、稳定表达等特点，现已成为神经科学研究中的重要工具。而要成功利用AAV在复杂的神经系统中实现对特定细胞类型的精准基因调控，关键在于选择合适的AAV血清型、细胞特异性启动子，以及高效的递送（注射）方式。
神经系统血清型选型全攻略
神经系统分为中枢神经系统（Central nervous system, CNS）和外周神经系统（Peripheral nervous system, PNS）。
CNS主要包括脑（Brain）和脊髓（Spinal Cord），是神经系统的核心部分，负责信息整合与发出指令，对机体的生理活动和行为反应起着主导作用；
PNS则由脑神经和脊神经组成，遍布全身，负责连接CNS与身体各部，传递感觉信息与运动指令，实现机体与外界环境的交互。
图1 神经系统结构组成[1]
外周神经
推荐使用血清型AAV- PHP.S、AAV- rh10、AAV9
AAV9是应用广泛的血清型，能穿过血脑屏障，全身注射可感染脊髓运动神经元，对PNS有良好的感染效果[2]。
AAV- rh10和AAV9效率相似甚至更高，当低剂量注射时，AAV- rh10比AAV9更有效地转导脊髓背侧和下运动神经元[3]。此外，AAVrh10在骨骼肌组织中具有感觉神经元趋向性，非常适合用于骨痛等相关研究。
AAV- PHP.S由AAV9改进而来，不仅扩散能力强，在外周神经系统中的转导效率也比AAV9更高，且可转导82%的背根神经节、心脏和肠神经元、以及一系列外周器官，尤其适合需要广泛标记PNS的研究[4]。
脊髓
AAV5、AAV6、AAV9和AAV- rh10均可以实现对完整小鼠脊髓的有效转导（图2）。其中AAV- rh10对神经元和神经胶质细胞具有更高的趋向性（图3），是在慢性期损伤脊髓中进行基因递送/转移的最合适的血清型[5]。
图2 AAV1-9和AAV-rh10对完整小鼠脊髓的有效转导
图3 慢性期损伤脊髓中AAV5、AAV6和AAV- rh10 的 细胞趋向性
AAV- PHP. eB、AAV-PHP. B和AAV- PHP.S由AAV9改造而来，可以实现小鼠脊髓的高效转导，且通过系统注射即可，操作方便。此外鞘内注射后，AAV9变体衣壳AAV-F也能介导非人灵长类动物脊髓中广泛的转基因表达[6]。
图4 不同AAV血清型静脉注射后
横断脊髓切片荧光图[4]
在小鼠中，AAV-DJ在体外和体内都表现出强大的转导效率，在靶向脊髓的同时去靶向肝和肾方面更优越。
图5 靶向脊髓的病毒滴度和荧光素酶
转基因转录水平[7]
研究人员通过髓鞘注射AAV2、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9、AAV- rh10等六种血清型，发现在脊髓背角AAV9和AAV- rh10血清型转导效率最高，且对背根神经节的感染效率也显著高于其它血清型。
图6 不同AAV血清型感染脊髓效果对比
此外，衣壳工程化改造带来了像AAV.CPP.16这样的新型变体，其在啮齿类和灵长类动物（食蟹猴）中均显示出优于AAV9的血脑屏障穿透能力和脊髓转导效率，为靶向CNS提供了更有力的工具[8]。
全脑感染
AAV9、AAV- PHP.eB、AAV- PHP.B、AAV-PHP.S，以及上面提到的AAV.CPP.16，这几种血清型均能透过血脑屏障，且扩散性很好。如果对感染效率要求较高，建议使用血清型PHP.eB或PHP.B。
图7 不同AAV感染全脑荧光图[4]
局部脑区
不同脑区由于细胞密度、组织结构和细胞类型的差异，对各类血清型的响应不同。下面的表格汇总了针对不同脑区的推荐血清型及其关键特点。
示踪方向
在顺向示踪（从胞体向轴突末端标记）中，AAV9是常用的非跨突触顺向示踪工具，能够高效标记投射神经元的轴突及其终端区域[9]；AAV1在高滴度下可实现顺向跨单突触传播，当其与Cre依赖的报告系统结合时，能特异性地标记突触后神经元，从而解析局部微环路连接[10]。此外研究表明，自互补型scAAV1的跨突触标记效率更优[11]。
在逆向示踪（从轴突末端回溯至胞体）方面，AAV2-retro表现出强大的逆向运输能力，可通过轴突末端摄取并高效逆向标记上游神经元，且不跨突触，使其成为解析神经元输入来源的利器[12][13]。AAV11也被证明具备优秀的逆行标记能力，并能特异性靶向星形胶质细胞[14]。此外，AAV-ROOT能特异性逆向标记支配外周器官（如脂肪组织）的背根神经节（DRG）感觉神经元，实现对脂肪组织神经支配的特异性操控[15]。
靶向特定细胞
AAV11可高效靶向星形胶质细胞[14]；
AAV5在大鼠皮层细胞原代培养中表现出胶质细胞嗜性[16]；
AAV-cMG.WPP和 AAV-cMG.QRP显著提高病毒对体外培养的小鼠小胶质细胞的侵染效率；
AAV-MG1.1/1.2能够在体内高效且特异性地转导小胶质细胞而不引起明显免疫激活[17]；
AAV-BI30可转导成年C57BL/6小鼠大脑、视网膜和脊髓血管系统中的大多数动脉、毛细血管和静脉内皮细胞[18]；
AAV. CAP-B10 表现出对中枢神经系统的特异性，高度靶向神经元细胞[19]；
精准原位标记
AAV13具有更小的扩散范围，且未表现出逆行标记或顺向跨突触特性，非常适合作为脑实质内精准原位标记工具[20]。
吉满生物提供丰富的AAV血清型选择，包括AAV1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, DJ, DJ/8, rh10, PHP.S, PHP.eB, Retro, CAP-B10, MG1.2等，全面覆盖从全脑广泛感染到特定核团精准标记，从中枢神经系统到外周神经系统的各类研究需求。
关于启动子的选择
目前，在神经科学研究中被广泛使用的广谱型启动子，如CMV、CAG、EF1A等，吉满生物均可提供，帮助实现目的基因在神经系统的靶向调控。
如果对特定细胞类型表达有要求的，吉满生物也推出神经系统特异性启动子，并支持个性化定制。将血清型的趋向性与细胞特异性启动子相结合，可以实现更加精准的基因表达调控。
选择策略与注意事项
√ 特异性vs强度
广谱启动子（如CAG）能提供高表达水平，但缺乏细胞特异性；细胞特异性启动子（如hSyn, GfaABC1D）精准度高，但表达水平可能稍低，需要根据实验目的权衡选择。
√ 载体容量限制
AAV的包装容量有限（~4.7 kb）。启动子的大小直接影响可用于容纳目的基因的空间，较长的启动子装载的目的基因长度有限。
√ 物种保守性
许多启动子（如hSyn, CaMKIIα）在啮齿类和非人灵长类动物中具有保守性，但表达模式可能存在物种差异，需通过预实验验证。
√ 组合使用
为实现更复杂的遗传操控，可以考虑将启动子与Cre-LoxP、DIO（双翻转）或化学遗传学/光遗传学工具结合使用。例如，使用细胞特异性启动子表达Cre重组酶，再与在目的脑区注射的Cre依赖性AAV（如DIO-AAV）配合，实现极高的特异性。
总结而言， 在AAV应用领域，精准的神经科学研究，始于对血清型和启动子的深刻理解与正确选择。
吉满生物有强大的资源平台、可靠的质量体系、丰富的项目经验和专业的服务团队，无论您的研究处于基础机制探索还是复杂疾病模型构建阶段，吉满生物都能提供精准匹配的技术方案。
下一篇，我们将深入讲解AAV的注射方式——从全身注射到精准的脑立体定位注射，如何根据实验设计做出最佳选择？敬请关注！
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参考资料：
[1] Nervous System Anatomy and Physiology.
https://nurseslabs.com/nervous-system/
[2] Bedbrook C N, Deverman B E, Gradinaru V. Viral Strategies for Targeting the Central and Peripheral Nervous Systems. Annual Review of Neuroscience. 2018, 41: 323-348.doi:10.1146/annurev-neuro-080317-062048.
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