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文章内容
Nature发布CRISPR重要新发现2015.3.4
吉满生物 2015-03-04

      一种强大的基因组编辑工具有可能很快会变得更为强大(延伸阅读:CRISPR操作指南进阶版:如何精确有效完成实验 )。来自劳伦斯伯克利国家实验室的研究人员解开了细菌能够从病毒和其他外源入侵物处“偷取”遗传信息,供自身免疫记忆系统使用的关键。研究结果发表在2月18日的《自然》(Nature)杂志上。论文通讯作者、伯克利实验室物理生物科学学部生物化学家、加州大学伯克利分校分子与细胞生物学系和化学系的Jennifer Doudna说:“我们证实细菌只需两个蛋白来推动这一过程:Cas1和Cas2。我们的研究结果为将所需的遗传信息导入到人类细胞中或是纠正现有基因组中的问题提供了一种替代方法。”

    细菌面对着来自病毒以及入侵核酸链质粒的不断攻击。为了在这样的攻击下生存下来,细菌和古细菌采用了多种防御机制,包括一种以称作为规律成簇间隔短回文重复(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat,CRISPR)的DNA元件为中心的适应性免疫系统。CRISPR DNA元件是由一些长度为30-60个核苷酸的“重复序列”组件构成,这些重复序列被长度变化为30-60个核苷酸的“间隔序列”(spacer)组件所间隔。 通过组合CRISPR和一些CRISPR相关“Cas”蛋白,细菌能够利用一些小的自定义RNA分子来沉默外源入侵物遗传信息的关键部分,通过“记住”先前遭受到的感染获得对未来相似入侵的免疫。现在Doudna和她的研究小组已率先解开了细菌基于CRISPR的免疫记忆背后的秘密。

    论文的主要作者、Doudna加州大学伯克利分校研究小组成员James Nuñez说:“我们了解到细菌从外源入侵物处获得一些关键的遗传信息片段,将这一信息作为新的间隔序列插入到了它们自身基因组的CRISPR位点中。这些外源的间隔序列从根本上说发挥了记忆库的功能。”但直到现在,人们都还不清楚细菌是如何从外源入侵物的基因组中偷取间隔序列,并将它们转递至宿主细菌的CRISPR位点的。采用大肠杆菌开展研究,并在体外高通量测序插入的间隔序列,Doudna、Nuñez和同事们发现记忆蛋白Cas1和Cas2识别了CRISPR位点中的重复序列,并使这些位点成为了间隔序列插入的靶标。Nuñez说:“宿主细菌CRISPR位点中的重复序列形成了一些DNA十字形结构,将Cas1和Cas2招募到这一位点实现间隔序列插入。这些十字形结构告诉了Cas1和Cas2将来自外源侵入物(病毒或质粒)的间隔序列精确地放置到何处。在这一过程完成后,宿主细菌对未来来自同类病毒或质粒的感染便产生了免疫。”

Doudna和她的研究小组认为,在未来或许可以利用携带所需信息如特异蛋白编码的DNA序列来编程Cas1和Cas2,利用另外的Cas1和Cas2蛋白将这一DNA插入到人类细胞基因组的适当位点中。Nuñez说:“结果表明,细菌和古细菌已在数百万年里它们的免疫过程中利用了Cas1和Cas2蛋白。我们接下来的任务是要阐明这一过程背后的规则以及如何将它们应用于人类细胞。


原文摘要:

Integrase-mediated spacer acquisition during CRISPR–Cas adaptive immunity Bacteria and archaea insert spacer sequences acquired from foreign DNAs into CRISPR loci to generate immunological memory. The Escherichia coli Cas1–Cas2 complex mediates spacer acquisition in vivo, but the molecular mechanism of this process is unknown. Here we show that the purified Cas1–Cas2 complex integrates oligonucleotide DNA substrates into acceptor DNA to yield products similar to those generated by retroviral integrases and transposases. Cas1 is the catalytic subunit and Cas2 substantially increases integration activity. Protospacer DNA with free 3′-OH ends and supercoiled target DNA are required, and integration occurs preferentially at the ends of CRISPR repeats and at sequences adjacent to cruciform structures abutting AT-rich regions, similar to the CRISPR leader sequence. Our results demonstrate the Cas1–Cas2 complex to be the minimal machinery that catalyses spacer DNA acquisition and explain the significance of CRISPR repeats in providing sequence and structural specificity for Cas1–Cas2-mediated adaptive immunity.

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