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基因敲除和基因下调

RNAi和基因敲除怎么选?

对于高等真核生物,RNAi介导的Knockdown是减少细胞中目的基因表达产物的最常用方法。然而,RNAi无法完全去除目的基因。

RNAi作用机制:由外源性导入、病毒激活及转座子活动等途径引入的dsRNA,井DICER酶处理后,反义siRNA与体内一些酶(外切酶、内切酶、解旋酶等)结合形成RNA诱导的沉默复合物(RISC),RISC与mRNA进行特异性结合,在结合部位切割mRNA,mRNA随即降解,除此之外,siRNA还可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶(RdRP)作用下合成更多新的dsRNA,新的dsRNA再由DICER切割产生大量次级siRNA,最终将mRNA完全降解。

在生物体内,RNAi介导的基因沉默原理分为mRNA降解或翻译抑制,最终导致在不改变遗传密码的情况下,转录后基因表达量下调。一些功能RNA或蛋白质的翻译水平会保持不变或降低。因此,用以减少基因功能的RNAi技术隶属于基因下调(Knockdown)方法,该方法无法完全去除基因功能。

与此相反,基因组编辑改变遗传密码,引起基因敲除(Knockout),以致完全缺失基因功能。这一敲除过程起始于染色体上双链断裂(DSB)的产生。目前,最热门的基因编辑技术就是CRISPR-Cas9了,它的作用机理是crRNA(CRISPR-derived RNA)与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成的复合物能特异性识别靶基因序列,并引导Cas9核酸内切酶在靶定位点剪切双链DNA,而通过人工设计这两种 RNA,可以改造形成具有引导作用的sgRNA (short guide RNA ),足以引导 Cas9 对 DNA 的定点切割。真核细胞对双链断裂的应答机制有两种:第一,非同源末端连接(NHEJ),两个游离的染色体末端重连。然而,NHEJ较容易出错,常常导致插入或缺失以致基因断裂或敲除;第二,细胞可通过同源重组修复HDR,这一修复机制为研究者提供了更多的基因敲除选择。例如:研究者可人为地引入敲除、特异突变引入、定点突变等。


那么,比较RNAi介导的基因下调和基因组编辑介导的基因敲除,哪种方法更好呢?这取决于具体实验目的。

很多人会将这两种方法混淆,将基因编辑当成“knockdown”,其原因是:在基因组编辑方法出现并运用于实验研究之前的许多年里,最实用且最常用的减少细胞中目的基因功能的方法是RNAi,近十年前RNAi方法的运用已经非常成熟。因此,研究者们已经习惯于使用“基因下调(Knockdown)”这个词。而近几年随着CRISPR的流行,也越来越多的人将RNAi当成“基因敲除”。

通常,如果不需要改变遗传密码时,RNAi介导的基因下调比基因组编辑更适用。例如,研究人员想要暂时减少基因功能时,可将siRNA瞬时转染到细胞中。多次传代后,siRNA丢失,基因功能恢复正常;再者,shRNA介导的基因下调不需要分离单克隆,从而减少了实验步骤,节省了大量时间和成本。最后,有时候完全去除基因功能可能会伤害细胞本身,但部分去除基因功能则不会。

但是,如果要在染色体上产生一个真正无效的等位基因,那么采用基因组编辑方法更佳。此外,研究人员可采用基因组编辑技术引入点突变或敲除,再者,利用该方法,研究者可添加融合标签到目的基因处并使其在特定位点表达,而实现这些实验目的都依赖于基因组编辑技术。


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