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技术服务 >技术资料 >CRISPR/Cas9
CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9技术

1.     CRISPR/Cas9系统简介

CRISPR/Cas 是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御,可用来对抗入侵的病毒及外源 DNA。CRISPR/Cas 系统通过将入侵噬菌体和质粒 DNA 的片段整合到 CRISPR 中,并利用相应的 CRISPR RNAs(crRNAs)来指导同源序列的降解,从而提供免疫性。

此系统的工作原理是 crRNA( CRISPR-derived RNA )通过碱基配对与 tracrRNA (trans-activating RNA )结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物,此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。而通过人工设计这两种 RNA,可以改造形成具有引导作用的sgRNA (short guide RNA ),足以引导 Cas9 对 DNA 的定点切割。

2.     CRISPR/Cas系统结构

CRISPR/Cas系统的组成主要包括:由不连续的重复序列(repeat)与长度相似的间区序列S(spacers)间隔排列而成的CRISPR簇,前导序列L(leader)以及一系列CRISPR相关蛋白基因Cas。


Cas蛋白是一种双链DNA核酸酶,能在guide RNA引导下对靶位点进行切割。

3.     CRISPR/Cas系统的作用机理

3.1CRISPR的高度可变的间隔区的获得

首先识别入侵的核酸和扫描外源DNA潜在的PAM(NGG序列),将临近的PAM的序列作为候选protospacer;然后再CRISPR基因座的5’端合成重复序列;最后新的间隔序列整合到两个重复序列之间。

3.2 CRISPR基因座的表达(包括转录和转录后的成熟加工)

当该噬菌体再次入侵细菌时,CRISPR簇首先转录为长的crRNA前体,然后逐步被加工成小的成熟的crRNA。

3.3 CRISPR/Cas系统活性的发挥或者是对外源遗传物质的干扰

crRNA结合相关的Cas蛋白后,形成crRNA-Cas蛋白复合体,通过碱基互补配对精确地与目标DNA相结合,随后Cas蛋白对目标DNA进行断裂和降解。



4. CRISPR-Cas系统的应用

4.1 CRISPR-Cas介导的基因组编辑技术

Ø  基因组编辑技术是一种可以在基因组水平上对DNA序列进行改造的遗传操作技术。

Ø  这种技术的原理是构建一个人工内切酶,在预定的基因组位置切断DNA,切断的DNA在被细胞内的DNA修复系统修复过程中会产生突变,从而达到定点改造基因组的目的。

Ø  通过修复途径,基因组编辑技术可以实现两种基因改造,即无模板的随即修复(NHEJ)和有模板的重组修复(HDR)

Ø  NHEJ包括:1.筛选插入或缺失非3的倍数个碱基突变的纯合子

2.大片段删除,包括lncRNA,miRNA删除

Ø HDR包括:1.基因敲入

2.定点突变

4.1.1        NHEJKNOCK OUT)——筛选插入或缺失非3的倍数个碱基突变的纯合子

Ø  针对目的基因分别设计3个sgRNA;

Ø  构建成sgRNA质粒;

Ø  病毒包装,细胞感染,切割效果鉴定;

Ø  单克隆测序验证,发货。




4.1.2        NHEJKNOCK OUT)——大片段删除,包括lncRNAmiRNA删除

    Ø   针对目的基因两端分别设计3个sgRNA;

    Ø   每端单独筛选出切割效果最好的sgRNA;

    Ø  将两端切割效果最好的sgRNA构建成双sgRNA质粒;

    Ø   病毒包装,细胞感染,切割效果鉴定;

    Ø   单克隆测序验证,发货。

4.1.3        NHEJ敲除稳转株构建




4.2 CRISPR-Cas介导的SAM激活

Ø  dead Cas9即dCas9

内切活性丧失的Cas9,dCas9在gRNA的导向下仍能靶向内源基因组的特定位点。

Ø  内源性激活基因表达

dCas9与转录激活域 (vp64)进行融合。VP64与p65及HSF1协同作用,增强内源基因的转录。

Ø sgRNA的设计

sgRNA引导复合物靶向内源基因转录起始位点(Transcriptional Start Site (TSS))的-200bp处,上调基因表达。



4.3 CRISPR-Cas介导的其他应用

4.3.1    基因修饰-甲基化/去甲基化


4.3.2    转录抑制



5.     GeCKOv2 human library

GeCKO文库是CRISPR gRNA的混合文库,可以在人的基因组内敲除任何基因及非表达的基因。每条gRNA克隆到优化过的慢病毒载体中以实现高效率地转染原代细胞或培养细胞。GeCKO文库应以较低的MOI值转导细胞,以保证每个细胞进入不超过1条gRNA。转染完成后在进行文库筛选之前,应对细胞进行NGS深度测序,以评估gRNA在细胞中的表现。文库筛选后,还需进行第二轮NGS测序并数据分析,以鉴定在筛选过程中缺失或富集的gRNA。通过GeCKO文库筛选找到真正的阳性克隆,鉴定哪些基因相对应的gRNA是被富集的。



针对人类基因组的每个基因,GeCKO文库的设计包含:6条单链gRNA(sgRNA)以及针对每个miRNA的4条sgRNA,及1000条非靶向性的对照sgRNAs。

这些gRNA分布在每个基因超过3-4个组成型表达的外显子上,以此将脱靶效应降至很低。每个文库均包括两个子文库A和B,每个子文库都分别包含针对每个基因的3个唯一的sgRNA;仅A文库包含可靶向1864 个miRNAs中任意一个miRNA的4条sgRNA。


二代测序分析:

Ø  对测序的原始reads进行质控和数据统计。

Ø  与客户指定的reference library进行比较分析,统计出测序reads数与reference中的gene ID的对应关系数据。

Ø 对于不同的样品进行比较分析,按照一定规则进行normalize,比较不同样品之间的差异,统计出差异倍数。

Ø  统计出同一Gene ID出现次数情况,找到出现0次和某个阈值次数以上的基因。

Ø  其他基于以上统计结果开展的一些分析工作。


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