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技术服务 >蛋白表达与纯化服务 >真核细胞蛋白的表达 >杆状病毒-昆虫蛋白表达及纯化
杆状病毒-昆虫蛋白表达及纯化

服务描述:

目前常用的杆状病毒表达载体有AcMNPV和BmNPV两种,我们选用的家蚕杆状病毒表达系统(BmNPV)是基于家蚕体内系统非常适合大规模制备外源蛋白,并且成本较低、方便、高效,而且翻译后加工也与天然蛋白极其相似。我们结合杆状病毒的转染与表达特性,以家蚕幼虫和蛹为宿主大量表达外源蛋白,为您提供快速,满意的蛋白表达服务。

 

服务内容:

服务步骤

主要内容

交付内容

交付时间

目的基因全基因合成

1. GenBank中寻找目的蛋白的cDNA序列。

2. 根据选用的表达系统对cDNA进行密码子及mRNA二级结构的优化。

3. 合成设计好的基因序列。

目的基因(连接在T载体或其它常规克隆载体上)及测序报告。

2

目的基因亚克隆到pFastBac供体质粒

1. 培养并抽提含有目的基因的载体质粒。

2. 将目的基因亚克隆到pFastBac供体载体上。

3. 测序验证构建质粒的准确性。

4. 通过中抽获得重组的质粒DNA

正确构建的重组表达质粒,含重组质粒的DH5α菌株及测序报告。

2-3

制备重组杆状病毒Bacmid DNA

1. 将重组的pFastBac供体质粒转化到大肠杆菌DH10Bac感受态菌株中。

2. 通过抗生素平板筛选出含有重组Bacmid的菌株。

3. 抽提质粒获得重组的杆状病毒Bacmid DNA

重组杆状病毒Bacmid DNA,含重组质粒的DH10Bac菌株

2

转染昆虫细胞Sf-9

1. 利用转染试剂将重组Bacmid质粒转入昆虫细胞Sf-9

2. 收集成熟的重组杆状病毒并检测病毒的滴度。3. 通过多次感染提高病毒的滴度,并扩增病毒数量。

4. 通过SDS-PAGEWestern-blot检测目的蛋白表达情况。

高滴度重组杆状病毒,病毒滴度及蛋白表达检测结果(如果转染不成功,则不收取费用。如果没有检测到目的蛋白表达,则只收取50%实验费用)。

3

目的蛋白表达及纯化

1. 培养500ml昆虫细胞至对数期,然后加入适量病毒感染细胞并表达目的蛋白。

2. 收集含有目的蛋白的部分(细胞或培养上清)。

3. 通过亲和,离子交换,疏水及凝胶过滤等多种层析方法纯化表达的重组蛋白。

4. 通过SDS-PAGE电泳检测每步结果并控制最终产品质量。

5. 通过Western-blot验证目的蛋白正确性。

6. 可提供表达细胞株:Sf-9Sf-9 MimicHigh Five

纯化好的目的蛋白0.1~2mg及纯化报告。可按客户要求提供含纯化标签(Tag)或切除纯化标签(Tag)的最终蛋白,纯度可达80%以上。

2-3

目的蛋白的再加工及详细检测

1. 内毒素去除,除菌,冻干等进一步加工。

2. 通过HPLC,质谱等方法详细检测目的蛋白的质量。

加工后的终产品及相关实验和检测报告。

2-3

大规模制备

按照小试工艺放大生产规模,制备客户需要的合格蛋白产品。

合格的目的蛋白及服务报告。

协商

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