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RNAi腺相关病毒

服务描述:

RNA干扰(RNA interference, RNAi) 现象是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的、由双链RNA(double-stranded RNAdsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。将与靶基因的转录产物mRNA 存在同源互补序列的双链RNA(double strand RNA, dsRNA) 导入细胞后,能特异性地降解该mRNA,从而产生相应的功能表型缺失。自从2006年对RNAi极为重视的克里格·梅洛(Craig Mello)获得诺贝尔奖以来,RNAi已经引起了多个领域科研者的关注和研究。包括对长度为21-28个核苷酸(nt)的微小RNAmiRNA)和内源性短干扰RNAendo-siRNA)的起源和功能以及细胞对RNA病毒的反应的新发现。其次,RNAi作为治疗剂的研究也在广泛的开展。第三,RNAi被用作基因和转录本特异性敲低mRNA水平的分子工具,这有助于大范围研究多种细胞,组织和生物体中的基因功能,。RNAi提供了一种经济、快捷、高效的抑制特异基因表达的技术手段,有助于研究该基因在生物模型系统中的作用,是研究基因功能的重要工具,并且逐步成为病毒性疾病、遗传性疾病以及肿瘤等的基因治疗研究的一种手段, RNAi为我们了解生命提供了新视角,并为医学发展提供了新工具。RNAi机制中最引人注目的亮点就是仅由20~30 nt组成的小dsRNA。它们是由RNaseIII酶(可以是Dicer单独发挥作用,也可以是DroshaDicer共同发挥作用)剪切长RNA得到的产物。按照小RNA的来源前体的不同,我们可以将其分为两大类:一是小干扰RNAsiRNA),它是细胞为了应对病毒感染或者其它人工导入分子而剪切外源性长dsRNA前体而生成;二是miRNA,它由细胞运用其自身基因组编码的茎环结构加工而来现.。不过,这些小RNA子都有一个共同的特征,那就是它们都能与Argonaute蛋白相结合,从而发挥它们的靶向作用。

RNAi制备的方法一般有:化学合成siRNA,哺乳动物细胞载体shRNA克隆,慢病毒载体shRNA克隆,腺病毒载体shRNA和腺相关病毒shRNA

服务流程:

定制/Easy RNAi腺相关病毒包装:


应用实例:


[1]Chadderton N, Millington-Ward S, Palfi A, et al. Improved retinal function in a mouse model of dominant retinitis pigmentosa following AAV-delivered gene therapy[J]. Molecular Therapy, 2009, 17(4): 593-599.
[2]Hitti FL, Siegelbaum SA. The hippocampal CA2 region is essential for social memory. Nature, 2014, 3;508(7494):88-92.
[3]Huang G H, Yang X T, Chen K, et al. Porf-2 Inhibits Neural Stem Cell Proliferation Through Wnt/β-Catenin Pathway by Its GAP Domain [J]. Frontiers in Cellular Neuroscience, 2016, 10(113):85.

 

附表1.各种RNAi制备方法的比较:

附表2.可供选择的载体;

附表3.不同血清型AAV的组织嗜亲性;

附表4.不同AAV血清型对相同的组织和细胞具有不同的感染效率;

附表5.各种病毒的特点;

附图6. RNAi作用原理。

 

附表1.各种RNAi制备方法的比较:

比较项目

化学合成siRNA

载体shRNA

慢病毒shRNA

腺相关病毒shRNA

siRNA结构

双链RNA或发夹结构RNA

发夹结构RNA

发夹结构RNA

发夹结构RNA

RNA干扰持续时间

<72小时

<10

>30

>60

适合的细胞系

转染效率大于70%细胞

转染效率大于20%,但是可以传代细胞

几乎所有细胞

多种血清型适应不同细胞

单次制备费用

重复使用费用

是否可自行扩增

不可以

可以

不可以

不可以

构建细胞稳转株

不满足

满足,但有风险

满足,可以同时制备多种稳定表达细胞系

满足

组织特异性干扰实验

不满足

满足

满足

满足

干细胞分化实验

不满足

不满足

满足

满足

裸鼠荷瘤实验

低重复性

低重复性

高重复性

高重复性

转基因knockdown

不满足

不满足

满足

满足

 

附表2.可供选择的载体:

 

编号

载体类型

载体用途

载体元件

PGMAAV-SB1

PGMAAV-SB1

PGMAAV-SB1

PGMAAV-SB1

PGMAAV-4381

PGMAAV-4381

PGMAAV-4381

PGMAAV-4381



附表3.不同血清型AAV的组织嗜亲性:

吉满生物在包装腺相关病毒时有多种不同的AAV血清型可供客户选择,建议客户针对不同组织器官选择相应血清型的AAV病毒,见下表。

血清型

组织亲和性

AAV1

肌肉,心脏,骨骼肌(包括心肌),神经组织

AAV2

中枢神经,肌肉,肝脏,脑组织,眼,

AAV3

肌肉,肝脏,肺,眼

AAV4

中枢神经,肌肉,眼,脑

AAV5

肺,眼,中枢神经,关节滑膜,胰腺 

AAV6

肺,心脏

AAV7

肌肉,肝脏

AAV8

肝脏,眼,中枢神经,肌肉

AAV9

心脏,肌肉,肺(肺泡),肝脏,中枢神经

DJ

视网膜,肝脏,肺,肾脏

DJ/8

大脑组织,其他离体组织

Rh10

肺,心脏,肌肉,中枢神经,肝脏

 

附表4.不同AAV血清型对相同的组织和细胞具有不同的感染效率:

Cell Line

AAV-1

AAV-2

AAV-3

AAV-4

AAV-5

AAV-6

AAV-8

AAV-9

AAV-DJ

AAV-DJ/8

Huh-7

13

100

2.5

0.0

0.1

10

0.7

0.0

500

0.2

HEK293

25

100

2.5

0.1

0.1

5

0.7

0.1

500

0.3

HeLa

3

100

2.0

0.1

6.7

1

0.2

0.1

667

0.2

HepG2

3

100

16.7

0.3

1.7

5

0.3

ND

1250

0.5

Hep1A

20

100

0.2

1.0

0.1

1

0.2

0.0

400

0.1

911

17

100

11

0.2

0.1

17

0.1

ND

500

0.0

CHO

100

100

14

1.4

333

50

10

1.0

25000

5.0

COS

33

100

33

3.3

5.0

14

2.0

0.5

500

0.3

MeWo

10

100

20

0.3

6.7

10

1.0

0.2

2857

1.0

NIH3T3

10

100

2.9

2.9

0.3

10

0.3

ND

500

0.1

A549

14

100

20

ND

0.5

10

0.5

0.1

1000

0.1

HT1180

20

100

10

0.1

0.3

33

0.5

0.1

333

0.2

Monocytes

1111

100

ND

ND

125

1429

ND

ND

100

ND

Immature DC

2500

100

ND

ND

222

2857

ND

ND

200

ND

Mature DC

2222

100

ND

ND

333

3333

ND

ND

100

ND

AAV-2 作为标准,感染效率为 100. ND =未检测

[1]Grimm D, Lee J S, Wang L, et al. In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses [J]. Journal of virology, 2008, 82(12): 5887-5911.

 

附表5.各种病毒的特点:

病毒表达系统

腺病毒表达系统

慢病毒表达系统

腺相关病毒系统

病毒基因组

双链DNA病毒

RNA病毒

单链DNA病毒

是否整合

病毒基因组游离于宿主基因组外,瞬时表达外源基因

病毒基因组整合于宿主基因组,长时间、稳定表达外源基因

低频整合

感染细胞类型

感染分裂和不分裂细胞

感染分裂和不分裂细胞

分裂和非分裂细胞

表达丰度

高水平表达

高水平表达

高水平表达

表达时间

快(1-2 天)

慢(2-4 天)

快(1-2 天)

滴度

滴度高达1E12pfu/ml

最高可达1E9-10TU/ml

最高可达1E9-13TU/ml

克隆容量

可插入高达8kb的外源片段,滴度随插入片段长度增加而降低

可插入不超过8kb的外源片段,滴度随插入片段长度增加而降低

可插入不超过3 kb外源DNA片段,滴度随插入片段长度增加而降低

免疫原性

高免疫原性

低免疫原性

低免疫原性

动物模型

不能得到转基因动物

可产生转基因动物,效率达50以上

可产生转基因动物

启动子

可以更换特异性启动子

可以更换特异性启动子

可以更换特异性启动子

能否用于MIRCORNA

可以

可以

可以

能否用于四环素诱导

不可以

TET-ON,TET-OFF

TET-ON,TET-OFF


 

附图6.RNAi作用原理:


 

其它相关产品:

Ø  现货光遗传AAV腺相关病毒

Ø  现货CRISPR/Cas9慢病毒(适用于难感染细胞)

Ø  CRISPR/Cas9基因敲除稳定株构建

Ø  慢病毒/腺病毒/腺相关病毒包装服务

Ø  报告基因构建与检测服务

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