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技术服务 >技术资料 >腺病毒包装流程介绍
腺病毒包装流程介绍

实验流程简介(AdMax包装系统)

用构建的腺病毒表达载体和骨架质粒共转染293细胞,包装病毒,收集病毒原液,超滤浓缩得到病毒浓缩液。

首先将构建成功的腺病毒重组质粒和包装质粒采用Qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取。所得的质粒质粒溶于无菌的TE中,以紫外光吸收法测定其浓度及纯度,保证所提质粒DNA A260/A2801.82.0之间。使用HG-Trans293TMtransfection reagent将构建好的病毒质粒及其辅助包装原件质粒共转染进293细胞,转染10~12h后加Enhancing buffer,接着8h后更换新鲜培养基,继续培养7-15天后,细胞脱落后收集富含病毒颗粒的细胞及上清液,得到p1代病毒,经过几轮扩增后,对得到的病毒进行浓缩后得到高滴度的病毒浓缩液。在一定滴度范围内的病毒颗粒可以满足大部分体内、体外实验需求。


实验材料

细胞株

293,腺病毒的包装细胞,为贴壁依赖型成上皮样细胞,生长培养基为DMEM( 10% FBS)

菌株

大肠杆菌菌株DH5α。用于扩增腺病毒载体和辅助包装质粒。

吉满生物常用腺病毒载体图谱

 

腺病毒基因过表达载体


腺病毒基因干扰载体

 

试剂

试剂名称

试剂来源

台盼兰

上海前尘生物

胎牛血清

GIBICO

DMSO

Sigma

DMEM

GIBICO

胰酶

GIBICO

HG transgene reagent

 

 

仪器

仪器名称

仪器来源

荧光显微镜

奥林巴斯

CO2培养箱

Thermo

生物安全柜

Thermo

离心超滤装置

MILLIPORE

 

腺病毒包装流程

1.       293细胞的培养

1)从液氮罐中取出冻存的细胞并迅速放入37℃热水中,轻轻晃动使细胞快速解冻。然后用70%的酒精擦拭细胞冻存管,拿入超净台中操作。以后所有步骤都应注意无菌操作。

2) 将冻存的细胞转移到15ml离心管中,后加4mL提前预热的培养基并轻轻混匀。1000 rpm离心5min。小心弃掉上清,并用适量培养基重悬细胞。

3)轻轻将细胞吹打散开,并转移到无菌的细胞培养皿中,置于37℃,CO2培养箱中培养。

2.       腺病毒包装与收集

1) 293细胞分盘

转染前一天,将已经长好的细胞以合适的比例传代到6 cm培养皿中,当细胞长到70%~80%时准备转染。

2) 转染前换液

转染前1~2 h 将需要转染的细胞换新鲜的培养基。

3) 转染

取无菌的1.5ml EP管或15ml离心管,转染体系按下表:

DMEM

0.5ml

过表达质粒

2μg

pBHG(delta)E1,3 cre

4μg

HG transgene reagent

18μl

 

混匀后,室温放置15min-20min后,均匀滴加到提前换过液的培养皿中,后置于CO2培养箱中培养。

4  Enhancing buffer

转染10~12h后,均匀滴加100×Enhancing buffer促进转染,120μl/皿。

5  换液

转染18~20h后,小心吸掉细胞培养液弃于盛有消毒液的废液杯中(注意:此时培养基中已含有少量的病毒,必须经处理后才能丢弃,所用的移液枪头等必须经消毒液浸泡至少20min后才能丢弃),然后加15ml无血清的DMEM(或加含血清的DMEM,具体的按客户要求)继续培养。

6) 病毒收集

病毒收集前要观察病毒空斑是否形成,感染后7天左右可以在显微镜下看到小的空斑,一般在1021天内形成,收集细胞及上清,反复冻融三次收集病毒,以此病毒为P1代病毒。

7)病毒扩增

P1代腺病毒感染293细胞,连续进行三代感染,至P4代进行腺病毒的大量扩增,待空斑形成后收集病毒并对病毒进行体外纯化和浓缩。

8) 病毒纯化

病毒纯化采用CsCl密度梯度离心-透析联用法纯化病毒,CsCl梯度的制备方法如下:加入2.0ml密度为1.40g/mlCsCl溶液,然后缓慢加入3.0ml密度为1.30g/mlCsCl溶液,再加入5ml的病毒悬浮,20000rpm,室温离心2小时。

收集密度在1.30g/ml1.40g/ml之间的病毒条带至透析袋中(透析袋使用前用10mMEDTANa2煮沸10min)。在透析缓冲液(50g蔗糖,10ml 1M Tris-HClPH8.02ml 1M MgCl2定容至1L)中,4℃搅拌透析过夜,中间换一次透析液。收集病毒,测定病毒滴度。

9)病毒重悬和保存

适量PBS重悬病毒沉淀,一周内使用则置于4度冰箱保存,如需长时间存放需置于-80度甚至液氮保存。

 

腺病毒使用方法请参考附件“腺病毒使用操作手册”。

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