设为首页 | 加入收藏
搜索:
网站首页产品中心技术服务订购方法关于我们
慢病毒
 过表达慢病毒服务
RNAi慢病毒服务
miRNA慢病毒服务
稳定细胞株构建
腺病毒
 腺病毒服务
腺相关病毒
 过表达腺相关病毒
RNAi腺相关病毒
miRNA腺相关病毒
lncRNA腺相关病毒
CRISPR/Cas9服务
 Cas9质粒构建
Cas9慢病毒服务
Cas9腺病毒服务
AAVS1-基因敲入
Donor vector
课题服务
 肿瘤相关课题研究
luciferase报告基因
技术服务 >技术资料 >siRNA产品使用说明
siRNA产品使用说明

siRNA 产品使用说明

 

产品简介:

常规化学合成 siRNA 为 21~23nt 的双链的小分子RNA,产品为冻干粉形式的即用型试剂。

运输保存:

产品以冻干粉的形式常温运输,收到产品后,请于-20℃~-80℃保存,冻干粉可以稳定保存2年。使用前瞬时离心,用RNase-free H2O 或灭菌 ddH2O 配制成 20μM 储存液,分装保存,避免反复冻融(不超过5次)。

表1:20μM 储存液的配方

siRNA nmol

2.5

5

10

50

溶解体积(μl

125

250

500

2500


使用须知:

1)siRNA 呈轻干膜状附在管壁上,打开管子请先离心,溶解时请加足量RNase-free H2O 或灭菌 ddH2O 后盖上管盖,震荡溶解。

2)避免外界因素(包括酶,极端PH或者温度条件等)导致产品降解,所有操作请严格遵循 RNA 操作规则。实验过程中,产品最好干冰上放置,使用完毕后请于-20℃~-80℃保存。


细胞实验方法

为了降低细胞密度,试剂使用量,转染效率等因素导致的空间差异,保证实验的可靠性和可重复性建议:

1)    转染实验中每个转染样品至少设置3个复孔;

2)    接种细胞量尽量保持一致,细胞在空中呈平均分布。


1.    转染浓度

1)为获得最佳基因阻断效果,每种细胞系转染 siRNA 的量需要经过实验验证。如果您是第一次 转染细胞,推荐使用几个lipofectamineTM2000 的浓度。并在 20~100nM 范围内改变 siRNA 的浓度,以确定最佳的阻断效果。高浓度的 siRNA 可能具有细胞系依赖性。

2)在 30~50%细胞汇合度时进行转染,通常基因沉默分析至少24~72h 进行。低密度转染细胞可 使细胞转染和分析间隔更长,从而使由于细胞过度生长造成的细胞活性过度损坏降到最低。根据靶基因 的特性,高密度转染的细胞可能更加适合条件的优惠。

3) 不要在转染时的培养基中加入抗生素,因为这将会将降低细胞转染的效率和导致细胞死亡。

4) 为了获得更好的结果,可以使用 invitrogen的Opti-MEM 低血清培养基在形成复


合物前稀释 lipofectamineTM2000 和 siRNA。可以使用荧光标记的 siRNA 帮助优化细胞系的转染条件。一旦确定了用来转染的最佳条件,可以在每一次实验都包括荧光标记 siRNA,作为转染效率的指示剂。

2.    转染步骤

以 lipofectamineTM2000 转染siRNA于24孔板,转染浓度为50nM 为例,其他规格容器转染见表2。

1) 接种细胞:

贴壁细胞:转染前24h,在400μl 无抗生素培养基中接种 0.5~2×105 个细胞,转染时细胞融合度为 30~50%。

(注:铺板时要将细胞消化完全混匀,避免细胞堆积生长。)

悬浮细胞:转染前 24h,在400μl 无抗生素培养基中接种 0.5~2×105 个细胞,转染时细胞数量 4~8×105/ 孔。

2) 转染步骤:

A.      用50μl Opti-MEM 稀释 siRNA(转染细胞的终浓度为 50nM),轻轻吹3~5次混匀。

B.       轻轻混匀转染试剂,用 50μlOpti-MEM 稀释1.0μl lipofectamineTM2000,轻轻吹3-5 次混匀,室温下静置5min。

C.       混合转染试剂和 siRNA 稀释液,轻轻吹3~5次混匀,室温下静置20min。

D.      转染复合物加入到 24 孔细胞板中,100μl/孔,前后轻摇细胞板混合均匀。

E.       细胞板置于37℃、5%CO2 培养箱中培养18~48h。转染 4~6h后可更换新鲜培养基。

3) 效果检测:

转染完成后 24~72h均可进行siRNA沉默效果检测,最佳检测时间与细胞类型,转染试剂,检测目的等相关。

A.     RNA 水平的检测:mRNA 是检测 siRNA 沉默效率的最佳指标,siRNA 转染后 24~72h 即可检测到靶基因 mRNA 表达明显降低,检测方法是   Real time PCR。

B.     蛋白水平的检测:检测方法是 Western blot。

C.     功能筛选:应用 EdU 细胞增殖、EdUTP 细胞凋亡等方法进行细胞功能筛选。


动物实验

修饰方法:由于动物实验对 siRNA 稳定性的要求较高,尽管未修饰的siRNA 也可以进行动物实验,但是以CHol,OMe,PS 修饰的 siRNA 效果较好。

给药方法:局部给药:最直接的导入方式,siRNA 的导入效率高,用量少。siRNA 能很快被吸收。适用于浅表器官和组织,包括眼,肌肉和皮下组织等。


表2:使用 lipofectamineTM2000转染siRNA 产品参考用量

细胞培养容器

表面积cm2

终浓度

lipo2000/

siRNA 产品

培养基总体积(每孔)

96-well

0.3

100nM

0.25 μl

0.5 μl

100 μl

50nM

0.25 μl

0.25 μl

100 μl

30nM

0.25 μl

0.15 μl

100 μl

20nM

0.25 μl

0.1 μl

100 μl

10nM

0.25 μl

0.05 μl

100 μl

24-well

2

100nM

1 μl

2.5 μl

500 μl

50nM

1 μl

1.25 μl

500 μl

30nM

1 μl

0.75 μl

500 μl

20nM

1 μl

0.5 μl

500 μl

10nM

1 μl

0.25 μl

500 μl

12-well

4

100nM

2.0 μl

5μl

1 ml

50nM

2.0 μl

2.5μl

1 ml

30nM

2.0 μl

1.5μl

1 ml

20nM

2.0 μl

1.0μl

1 ml

10nM

2.0 μl

0.5μl

1 ml

6-well

10

100nM

5.0 μl

10μl

2 ml

50nM

5.0 μl

5μl

2 ml

30nM

5.0 μl

3μl

2 ml

20nM

5.0 μl

2μl

2 ml

10nM

5.0 μl

1μl

2 ml



温馨提示:

您在验证靶点时,除设置常规空细胞/NC/siRNA1/ siRNA2/ siRNA3 四组,还可增加 siRNA1/2/3 mix组。

Copyright © 2011-2017 吉满生物科技(上海)有限公司 版权所有沪ICP备12003778号-1