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文章内容
预制shRNA表达克隆
吉满生物 2013-10-23

吉满生物针对客户提供的靶基因找出干扰的靶点序列,并设计成带有发夹结构的shRNA序列(小发夹结构RNAi)将其装于表达载体中,我公司提供多套RNAi表达载体,可用于人、小鼠、大鼠以及其他物种的全基因组范围内的基因表达抑制研究。

各种siRNA制备方法比较

比较项目

化学合成siRNA

DNA载体shRNA

慢病毒载体shRNA

RNA干扰持续时间

<72小时

<10

>30

适合细胞系

转染效率大于70%细胞

转染效率大于20%细胞

几乎所有细胞

单次制备费用

重复使用费用

构建稳定表达siRNA的细胞株

不满足

满足,但有风险

满足,可以同时制备多种稳定表达细胞系

组织特异性干扰实验

不满足

满足

满足

干细胞分化实验

不满足

不满足

满足

裸鼠荷瘤实验

低重复性

低重复性

高重复性

 

应用范围:

  • 基因功能研究
  • 信号通路分析
  • 基因过表达的确证


常用检测方法:

  • qRT- PCR:shRNA通过与靶基因mRNA结合后,导致mRNA的切割和降解,可以降低靶基因的蛋白的表达。设计目的基因的qRT-PCR引物,通过qRT-PCR检测mRNA变化,确定knockdown效率。
  • western blot:通过检测干扰靶基因目的蛋白的表达水平的下调,确定shRNA 对靶基因的表达抑制作用。
  • 基因功能检测:通过生物和生化的终点分析方法,分析细胞增殖、克隆形成、细胞周期、细胞迁移等,根据目的基因具体的功能而定。

 

可选RNAi载体:

载体编号

元件顺序

用途

基因导入

真核抗性

荧光标记

pGMLV-SB1

hU6-MCS-CMV-eGFP

RNAi

慢病毒载体

/

eGFP

pGMLV-SB3

hU6-MCS-CMV- Puromycin

RNAi

慢病毒载体

Puromycin

/

pGMLV-SB4

hU6-MCS-CMV- RFP

RNAi

慢病毒载体

/

RFP

pGMLV-SB5

hU6-MCS-EF1α- eGFP

RNAi

慢病毒载体

/

eGFP

pGMLV-SB6

hU6-MCS-UBC- eGFP

RNAi

慢病毒载体

/

eGFP

pGMLV-SC2

CMV-RFP-hU6-MCS-PKG-Puromycin

RNAi

慢病毒载体

Puromycin

RFP

pGMLV-SC5

hU6-MCS-CMV-eGFP-PKG-Puromycin

RNAi

慢病毒载体

Puromycin

eGFP

pGMLV-SC6

hU6-MCS-CMV-RFP-PKG-Puromycin

RNAi

慢病毒载体

Puromycin

RFP

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