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技术服务 >技术资料 >慢病毒包装流程介绍
慢病毒包装流程介绍

实验流程

制备编码慢病毒颗粒的重组病毒质粒及其辅助包装原件载体质粒,重组质粒载体和辅助质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提,使用HG transgene reagent进行共转染 293T细胞,转染后8h 更换为完全培养基,培养48h后,收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液,对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液,在293T细胞中测定并标定病毒滴度。在一定滴度范围内的慢病毒颗粒可以满足大部分体内体外实验需求。

实验材料

细胞株

293T,慢病毒的包装细胞,为贴壁依赖型成上皮样细胞,生长培养基为 DMEM(含 10% FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。

菌株

大肠杆菌菌株 DH5α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。

病毒载体

pGMLV-Lu载体图谱:(具体结构请参考“报告基因慢病毒说明书”)

DNA溶液的制备:以Qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取慢病毒包装系统中各种质粒DNA,质粒DNA溶于除菌的TE中,以紫外光吸收法测定其浓度及纯度,保证所提质粒DNA 的 A260/A280在1.8~2.0之间。 

试剂

试剂名称

试剂来源

台盼兰

上海前尘生物

胎牛血清

GIBICO

DMSO

sigma

DMEM

GIBICO

胰酶

GIBICO

HG transgene reagent

 

仪器

仪器名称

仪器来源

荧光显微镜

奥林巴斯

CO2培养箱

Thermo

生物安全柜

Thermo

离心超滤装置

MILLIPORE

病毒的包装

1. 293T细胞的培养

1)从液氮罐中取出冻存的细胞并迅速放入37℃热水中,轻轻晃动使细胞快速解冻。然后用70%的酒精擦拭细胞冻存管,拿入超净台中操作。以后所有步骤都应注意无菌操作。

2) 将冻存的细胞转移到15ml离心管中,后加4mL提前预热的培养基并轻轻混匀。1000 rpm离心5min。小心弃掉上清,并用适量培养基重悬细胞。

3)轻轻将细胞吹打散开,并转移到无菌的细胞培养皿中,置于37℃,CO2培养箱中培养。

2. 慢病毒包装与收集

1)   293T细胞分盘

转染前一天,将15cm培养皿中已经长好的细胞以合适比例传代到10cm培养皿中,当细胞长到70%~80%时准备转染。

2)   转染前换液

转染前1~2 h 将需要转染的细胞换新鲜的培养基,12ml/10cm皿,注意:293T细胞贴壁性不是很好,换液时应小心滴加尽量避免冲起细胞。

3)   转染

取无菌的1.5ml EP管或15ml离心管,转染体系按下表:

无血清的DMEM

1ml

质粒

10μg

Lentivirus Mix

10μl10μg

HG transgene reagent

60μl

混匀后,室温放置15min-20min后,均匀滴加到提前换过液的培养皿中,后置于CO2培养箱中培养。

4)   加Enhancing buffer

转染10~12h后,均匀滴加100×Enhancing buffer促进转染,120μl/皿。

5)   换液

转染18~20h后,小心吸掉细胞培养液弃于盛有消毒液的废液杯中(注意:此时培养基中已含有少量的病毒,必须经处理后才能丢弃,所用的移液枪头等必须经消毒液浸泡至少20min后才能丢弃),然后加15ml无血清的DMEM(或加含血清的DMEM,具体的按客户要求)继续培养。

6)  病毒收集

换液48h后,吸取细胞上清液于50ml离心管,4℃,4500g离心5min,上清液用0.45μm滤器过滤后转移到新的离心管中,最后将滤液分批转移到centrifugal filter devices 中,4℃,4500g,离心10min,弃下层的液体于盛有消毒液的废液杯中,最后一次4℃,4500g,离心20min,此时可见滤器上层中有200~250μl液体即为病毒浓缩液(如换液用的是加了FBS的DMEM,则病毒浓缩液可达到400~500μl)。

7)  病毒分装与保存

将病毒以40~50μl分装,后保存于-80℃。


慢病毒使用方法请参考附件“慢病毒使用操作手册”。

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