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siRNA

siRNA 是分子中的一种短 (21-23 bp) 双链 RNA 核苷酸，在细胞中发挥各种生物系统的功能。

siRNA转染是利用小干扰RNA（siRNA）来靶向并沉默特定基因的一种技术，广泛应用于基因功能研究和疾病防治等领域。这项技术涉及将siRNA导入细胞中，从而通过RNA干扰（RNAi）机制降低靶基因的表达。

为了成功优化 siRNA 转染，需要合适的转染试剂和转染方法来进行体外和体内RNAi 实验。这些过程因细胞类型和转染方法而异。

siRNA转染原理

siRNA它通过与细胞内特定mRNA序列的互补配对，触发RNA干扰机制，从而抑制对应基因的翻译。这一过程主要涉及以下几个步骤：

1、siRNA通过不同的转染方法（如磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、阳离子脂质体转染等）进入细胞

2、细胞内的Dicer酶将双链RNA切割成小片段，并与RNA诱导沉默复合体（RISC）结合

3、反义链与靶mRNA配对，导致mRNA降解，从而阻止其翻译成蛋白质

图片来源于网络

siRNA无效经验总结

1、你的siRNA真的转入细胞了吗？

转染效率有多少？

一、siRNA发挥作用的前提是要成功进入到细胞质中。

二、用荧光标记比如Cy3 siRNA作为荧光对照，预实验确认荧光效率及对应的siRNA转染最佳浓度。要注意的是，cy3荧光在细胞外呈“亮点状”，进入细胞质中荧光形态与细胞形态基本一致，大部分能观察到“质亮核暗”的现象。

三、荧光（转染）效率应高于90%才能有效抑制目的基因的mRNA表达。如果少量siRNA进入细胞，作用于基因后，有时候细胞会有补偿机制，表达量反而升高。

四、也可以借助阳性对照siRNA判断转染效率。如果阳性对照基因干扰效率能达到70%以上，说明转染成功且转染效率较高。

2、siRNA可以转染进细胞

但干扰效果不理想？

一、检测时间点：建议转染后48小时检测RNA水平变化，48-72小时检测蛋白水平变化。不同基因的半衰期是不同的，siRNA干扰是抛物线形的，多做几个时间点有利于siRNA干扰效果的测定。过于密集的细胞将影响细胞状态，从而影响实验结果。

二、推荐qRT-PCR引物设计在target位置的两侧，而不是同侧。目前已经知道的siRNA介导的基因knockdown机制是RSIC先介导靶mRNA的切割，切割导致靶mRNA的降解，由于切割和降解可能具有不同的时间点，因此，设计于同侧的PCR引物可能导致假阴性结果或knockdown效率的低估。

三、基因表达：目的基因在细胞中无本底或者几乎不表达（比如Ct值>30），如果这样，建议换一种细胞看看。

四、干扰靶点不合适，需重新设计siRNA，可参考文献序列。

五、此外，还应排查qRT-PCR的扩增效率，熔解曲线是否异常，内参Ct值是否处于13~18之间，三重复数据差异，组间内参表达差异。

3.转染效率低的原因？

一、转染体系：siRNA用量（终浓度建议在30-120nM），转染试剂和siRNA使用比例，有无血清要求，无抗生素转染等。

二、转染试剂：根据实验要求和细胞特性选择适合的转染试剂。

三、细胞原因：转染效率跟细胞状态、细胞代数、细胞密度等有关，一般低的细胞代数（<50）能确保基因型不变。最适合转染的细胞是经过几次传代后达到指数生长期的细胞，细胞生长旺盛，最容易转染。有的细胞出了名难转染，比如悬浮、干细胞、原代细胞等，可以尝试慢病毒、电转等。

吉满生物siRNA合成服务

吉满生物可根据客户提供的目的基因信息，设计并合成siRNA,也可以根据实验需求，提供多种荧光标记和化学修饰的siRNA。