传统的基因编辑工具主要包括一代ZFN、二代TALEN和三代CRISPR技术，ZFN与TALEN技术都是使用包含DNA识别结合域和DNA切割域的核酸酶，但存在靶标识别率低、成本高、脱靶概率高和结构复杂等问题，因此，推动了三代CRISPR技术的发展。
ZFN | TALEN | CRISPR/Cas9 | |
靶点DNA序列的识别区域 | 锌指(ZF)结构域 | 重复可变双残基(RVD)的重复 | CRISPR RNA (crRNA) 或sgRNA |
DNA的剪切 | Fok1核酸酯结构域 | Fok1核酸酯结构域 | Cas9蛋白 |
识别靶点大小 | (9或12bp)*2 | (8-31bp)*2 | 20bp +NGG |
优点 | 平台成熟，效率高 | 设计较ZFN简单，特异性高 | 靶向精确 |
设计构建 | 最难 | 较难 | 容易 |
甲基化敏感程度 | 敏感 | 敏感 | 不敏感 |
脱靶效应 | 低 | 极低 | 稍高 |
切割效率 | 高 | 高 | 最高 |
（基因编辑工具对比）
CRISPR/Cas9系统已经成为基因编辑的有力工具，用于准确、高效地编辑生物体的基因组。在基因研究、基因治疗和基因育种等方面展示出了巨大的应用前景。运用CRISPR技术实现基因编辑，需要将CRISPR/Cas9系统的两个核心元素sgRNA和Cas9蛋白递送到细胞内，目前主要有三种递送形式：
(1) 质粒瞬转：采用分别表达sgRNA和Cas9的DNA质粒(或sgRNA和cas9共表达质粒)共转染细胞，在细胞内通过质粒瞬时表达gRNA和Cas9蛋白，进而实现对靶基因的编辑。
(2) RNA瞬转：体外合成sgRNA和表达Cas9蛋白的mRNA，通过瞬时转染技术将两者递送至细胞内，Cas9的mRNA可由细胞翻译合成Cas9蛋白，进而实现对靶基因编辑。
(3) 蛋白瞬转(RNP)：体外将Cas9蛋白和sgRNA混合，二者可以结合形成核糖核蛋白(ribonucleoprotein, RNP)，然后通过瞬时转染技术(脂质体或电转等)可将RNP复合效应物递送到细胞内，进而实现对靶基因的编辑。
根据递送形式以及不同的细胞，可以选择不同的递送方法，主要包括：物理方法、化学方法、以及病毒转导。其中，利用慢病毒转导质粒和电穿孔递送RNP是将CRISPR/Cas9导入细胞的两种主要方法。
CRISPR/Cas9技术的常规应用
基因敲除
在基因的上下游各设计一条向导RNA，将其与含有Cas9蛋白编码基因的质粒一同转入细胞中，向导RNA通过碱基互补配对可以靶向PAM附近的目标序列，Cas9蛋白会使该基因上下游的DNA双链断裂。
生物体自身存在着DNA损伤修复的应答机制，在通常情况下，细胞会采用高效的非同源末端连接方式(NHEJ)对断裂的DNA进行修复，会将断裂上下游两端的序列连接起来，从而实现了细胞中目标基因的敲除。
基因敲入、定点突变
在上下游DNA双链断裂基础上，引入一个修复的模板质(供体DNA分子)，基因组断裂部分会依据修复模板进行同源重组修复(HDR)，细胞按照提供的模板在修复过程中引入片段插入或定点突变。
基因抑制、基因激活
Cas9的特点是能够自主结合和切割目的基因，通过点突变的方式使Cas9的两个结构域RuvC-和HNH-失去活性，形成的dCas9只能在sgRNA的介导下结合靶基因，而不具备剪切DNA的功能。因此，将dCas9结合到基因的转录起始位点，可以阻断转录的开始，从而抑制基因表达；将dCas9结合到基因的启动子区域也可以结合转录抑制/活化物，使下游靶基因转录受到抑制或激活。因此dCas9与Cas9、Cas9 nickase的不同之处在于，dCas9造成的激活或者抑制是可逆的，并不会对基因组DNA造成永久性的改变。
多重编辑（Multiplex Editing）及功能基因组筛选
将多个sgRNA质粒转入到细胞中，可同时对多个基因进行编辑，具有基因组功能筛选作用。
利用CRISPR/Cas9进行基因编辑可以产生大量的基因突变细胞，因此利用这些突变细胞可以确认表型的变化是否是由基因或者遗传因素导致的。目前CRISPR的基因组筛选功能应用于筛选对表型有调节作用的相关基因，如对化疗药物或者毒素产生抑制的基因、影响肿瘤迁移的基因以及构建病毒筛选文库对潜在基因进行大范围筛选等。
高效的基因编辑工具 - Cas9核酸酶稳定表达细胞系
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Cas9核酸酶稳定表达细胞系应用
一、高通量筛选
sgRNA高通量筛选，功能验证，确定sgRNA编辑效率；
二、基因编辑模型
转染sgRNA或同时转染sgRNA和供体DNA，实现基因敲除\基因敲入\点突变；
三、基因功能研究
可用于长期在某一类细胞中研究不同基因的生物学功能。
