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骨肉瘤（osteosarcoma）是一种由原始间充质细胞形成的致命原发性骨骼肿瘤，具有高转移潜能，很容易转移到肺部，然后转移到身体其他器官。骨肉瘤的高转移潜力与低生存率相关，发生转移性的患者5年生存率为20%。即使采用最佳诱导治疗，30-40%的骨肉瘤患者复发率仍达80%，且极易在肺部复发。因此亟待明确转移性骨肉瘤的分子机制，以便开发有效的治疗干预措施。

中国医科大学医学院等发表在International Journal of Biological Sciences杂志中题为：Apelin promotes osteosarcoma metastasis by upregulating PLOD2 expression via the Hippo signaling pathway and hsa_circ_0000004/miR-1303 axis的研究，探究了促进骨肉瘤转移的分子机制，即一种脂肪因子Apelin (APLN)通过Hippo信号通路与hsa_circ_0000004/miR-1303信号轴上调PLOD2的表达，从而促进人骨肉瘤细胞的迁移。

细胞外基质（ECM）的转化在骨肉瘤的增殖和转移中起着关键作用，其主要成分胶原蛋白，为ECM的组装提供了支架。胶原蛋白的交联和沉积依赖于PLOD家族，部分研究显示PLOD2在多种肿瘤中高表达，参与胶原交联、胶原纤维互作和肿瘤运动等。Apelin(APLN)是G蛋白偶联受体Aplin受体(APJ)的内源性配体之一，是一种具有广泛生理学功能的内源性多肽，参与调节肿瘤增殖、血管生成和转移，能量代谢等生理学过程，见于非小细胞肺癌、卵巢癌和胆管癌等多种癌症，这也表明APLN在癌症转移中起着关键作用，然而APLN和PLOD2是否影响骨肉瘤的迁移，作者展开了如下研究。

首先，作者针对正常骨和骨肉瘤标本进行了免疫组化和定量检测，结果显示APLN和PLOD2在骨肉瘤组织中高表达，且表达丰度与骨肉瘤临床分期显著相关；其次，GEO数据集分析与此一致。

图1 人骨肉瘤组织中APLN的临床病理特征

图2 APLN与PLOD2在人骨肉瘤组织中的表达呈正相关

作者进一步研究了骨肉瘤转移与APLN和PLOD2的作用机制，通过Transwell试验、qPCR和Western blot分别检测体外迁移活性、PLOD2 mRNA和蛋白的表达，证实了APLN剂量依赖性地促进骨肉瘤细胞的迁移，APLN通过刺激骨肉瘤细胞（143B和MG-63）使得PLOD2 mRNA和蛋白表达显著增加。在PLOD2抑制剂（米诺地尔）预处理或转染PLOD2 siRNA的情况下，对APLN促迁移的作用产生了抑制。也就是说，在骨肉瘤中，APLN通过增加PLOD2的表达来促进细胞迁移。

图3 APLN通过增加PLOD2表达促进骨肉瘤细胞迁移

为了探究更深入的机制作用，作者参考了在肿瘤转移中可发挥重要作用并与骨肉瘤相关的PI3K/Akt/mTOR、NF-κB、JAK/STAT、Hippo和缺氧信号通路。通过qPCR检测可推断Hippo信号通路参与了APLN诱导的骨肉瘤细胞迁移的过程。利用小干扰抑制Hippo通路关键分子MST1和MOB1表达后，可显著抑制APLN对细胞迁移活动的影响，以及PLOD2 mRNA和蛋白表达水平。该部分结果说明了MST1/MOB1通路参与APLN诱导骨肉瘤细胞迁移并增加PLOD2的表达。

图4 Hippo信号通路参与APLN诱导的PLOD2 mRNA表达

图5 MST1/MOB1通路参与APLN诱导骨肉瘤细胞迁移并增加PLOD2的表达

YAP作为Hippo通路的主要下游效应分子，其激活可调控与增殖、转移相关基因表达。使用YAP抑制剂及YAP siRNA实施阻断后，APLN对细胞迁移的影响变弱，PLOD2 mRNA和蛋白的表达降低。此外，采用ChIP和qPCR验证了YAP与PLOD2启动子的调控互作。

图6 YAP通路与APLN诱导的骨肉瘤细胞迁移有关，并增加PLOD2的表达

miRNAs能够通过结合mRNA的3’-UTR调控蛋白编码基因，在人类癌症的发生和转移中发挥重要作用。为此进一步检索得到5个与PLOD2的3'-UTR结合miRNAs（miR-330-3p、miR-513a-3p、miR-944、miR-1303和miR-1305），其中miR-1303经APLN处理验证显示表达明显降低，且miR-1303水平受到浓度依赖的抑制；与正常骨组织相比，miR-1303在人骨肉瘤组织中的表达明显下调；且miR-1303 mimic可以消除APLN诱导的细胞迁移和PLOD2表达的促进。此外，双荧光素酶报告基因检测验证了APLN与PLOD2可以直接相互作用。

图7 APLN通过下调miR-1303的表达，增强PLOD2的表达并促进骨肉瘤细胞迁移

环状RNA(circular RNAs)被认为是miRNA的海绵，导致miRNA功能受到抑制。经由环状RNA相互作用体分析，作者预测得到circ_0078767、circ_0094088、circ_0000004、circ_0000003、circ_0000051和circ_0000090可与miR-1303产生结合，且验证发现其中circ_0000004在骨肉瘤细胞中表达量最高。为了进一步明确circ_0000004和miR-1303对骨肉瘤细胞的作用机制，作者使用了小干扰抑制、荧光素酶报告基因检测、Pull-down试验及mRNA测定，证实了APLN通过上调circ_0000004抑制miR-1303的表达，进而解除对下游靶基因PLOD2的抑制作用，促进骨肉瘤细胞的迁移能力。

图8 APLN通过上调miR-1303的circ_0000004海绵作用来增强骨肉瘤细胞迁移，并增加PLOD2的表达

为了进一步证实APLN在体内对骨肉瘤细胞迁移和PLOD2表达的影响，作者建立了稳定表达APLN shRNA细胞系，通过Western blot，生物发光成像监测肿瘤转移情况及免疫组化染色分别进行检测，结果显示APLN shRNA细胞系中APLN和PLOD2蛋白表达明显受到抑制，细胞迁移显著减少，APLN敲除能够显著抑制肺转移的发生。