一. 背景简介
永生化 是一种细胞生物学术语。是指动物细胞脱分化失败，受到病毒感染，外源恶意代码转染，辐射或药剂作用后，细胞分裂次数限制机制和DNA检查-自毁机制失灵，导致细胞具有无限分裂生长的能力的过程成为细胞永生化。
（永生化原理图）
二.不同的细胞永生化方法
HPV 可介导人的包皮细胞、角化上皮以及乳腺、胰导管和口腔等的上皮细胞永生化；
猿猴病毒的SV40大T抗原 (TAg)用于黏附细胞、成纤维细胞、内皮细胞等；
EBV 用于淋巴母细胞样细胞；
端粒酶TERT 用于间充质干细胞和其他一些细胞。
三.案例解析
赫特维希上皮根鞘(HERS)原代细胞永生化解决方案
Li et al. Stem Cell Research & Therapy(2019) 10:3
赫特维希上皮根鞘(Hertwig’s epithelial root sheath, HERS)细胞是一群在牙根发育以及牙周组织形成过程中发挥重要作用的特殊细胞。在牙根发育过程中，HERS通过上皮-间充质转化（EMT）向成牙骨质细胞分化，并通过上皮-间充质相互作用（EMI）诱导牙乳头向成牙本质细胞分化，在引导牙根形成中发挥重要作用。
实验动物：PN8大鼠
组织：第一下颌磨牙
分离原代细胞：解剖PN 8时下颌第一磨牙根尖区的Hertwig上皮根鞘，用2.4 U/mL分散酶和625 U/mL胶原酶解离组织（图a）
培养条件：由基础培养基、2%胎牛血清、1%上皮细胞生长添加剂和1%青霉素/链霉素溶液组成
生长特性：贴壁，呈典型的鹅卵石样外观（图b）
吉满生物助力工具病毒
pGMLV-SV40T-PURO慢病毒
构建永生化流程
01用编码猿猴病毒40大T抗原(SV 40 LT)和嘌呤霉素抗性基因的慢病毒载体(pGMLV-SV 40 T-PURO,Genomeditech,Shanghai,China)转染第1代纯化的原代HERS细胞
02转染后，通过向培养基中补充2 μg/ml嘌呤霉素筛选细胞
03使用有限稀释法，将细胞分离为单细胞，并培养扩增所选克隆
04通过克隆形成细胞的筛选，共筛选出68个克隆，这些克隆可培养50代以上
永生化细胞特性与鉴定
其中，两个细胞系命名为HERS-H1和HERS-C2，呈鹅卵石样形态（图d），是贴壁的，具有高增殖能力，倍增时间约为24小时（图e）；
HERS细胞标志物：细胞角蛋白14（CK14）、上皮钙粘蛋白（E-cadherin）和间充质波形蛋白（vimentin）均呈阳性表达，提示细胞同时具有上皮细胞和间充质细胞的特征，且HERS细胞标志物的表达维持至少20代（图f）。
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