乳腺癌（Breast Cancer, BC）在世界范围内是女性患癌的首要类型，占癌症患者中的25%。
根据乳腺癌细胞受体类型，将乳腺癌大致划分为雌激素阳性ER+，孕激素阳性PR+，人类表皮生长因子受体2阳性HER2+和三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)。
TNBC主要表现为增殖快、转移早、复发率高、缺乏分子靶点治疗而预后较差，是导致TNBC高死亡率的关键因素，因而成为研究者们主要的研究对象。
文献来源
山东大学齐鲁医院发表在Molecular Therapy杂志中题为:circ-EIF6 encodes EIF6-224aa to promote TNBC progression via stabilizing MYH9 and activating the Wnt/beta-catenin pathway的研究中，探究了TNBC肿瘤发生的分子机制，即circ-EIF6通过编码肽段EIF6-224aa，与致癌基因MYH9相互作用，抑制泛素-蛋白酶体途径进而激活Wnt/ β-catenin通路促进TNBC进展。
circRNA分子研究主要集中在circRNA的“海绵”机制抑制miRNA表达及RNA结合蛋白的支架分子上，可编码蛋白的环状RNA由于其特殊的环状特性，能以更稳定的方式表达蛋白质，近年来也成为一大研究热点。
目前已经证明了这些环状RNA及其蛋白产物在癌症中的关键作用，包括胶质母细胞瘤、肝癌和结肠癌。然而蛋白质编码环状RNA在TNBC中的重要作用尚未被充分研究。
TNBC肿瘤中 circ-EIF6发现与鉴定
首先，作者利用高通量测序技术筛选TNBC肿瘤组织与BC组织中差异表达的circRNAs，并与231和231_M细胞水平RNA-seq结果取交集，证实有9个circRNAs显著差异表达。
基于一些临床病理数据分析，作者将选定circ-EIF6作为TNBC肿瘤研究的主分子，它的表达量高低与TNBC肿瘤细胞的转移能力呈正相关，circ-EIF6的高表达预示着总生存率的预后更差。
随后，通过Sanger测序，RNase R酶消化，PCR扩增，半衰期检测等一系列实验，鉴定circ-EIF6具有头尾剪接的环状特征。利用siRNA沉默circ-EIF6表达后，抑制了TNBC细胞的增殖、迁移和侵袭能力，细胞周期阻滞。
circ-EIF6编码肽EIF6-224aa
针对circ-EIF6序列分析发现包含一段675nt ORF，揭示circ-EIF6可能编码一个224 aa的肽，于是编码蛋白的能力在蔗糖密度梯度离心的多体分析中得到证实。
此外，通过生物信息学分析，作者使用双荧光素酶和双顺反子报告系统实验证明了circ-EIF6中内部核糖体进入位点（IRES）序列活性。IRES序列有着特殊高级结构，是一段可以与核糖体结合直接起始翻译的序列，对于没有5’帽结构的circRNA而言，拥有IRES序列也是其有编码蛋白潜力的必要因素。
进一步设计circ-EIF6-FLAG检测circ-EIF 6编码的肽，其中Flag序列被分割并克隆在circRNA序列两侧，Western检测到EIF6-224aa-FLAG的表达，表明circ-EIF6具有蛋白编码能力。通过LC-MS分析鉴定了EIF6-224aa的特异性肽序列并生产抗体表达用于后续EIF6-224aa表达检测。
EIF6-224aa功能和机制研究
在EIF6-224aa的功能研究中，EIF6-224aa-FLAG和circ-EIF6-OV组均显著促进了TNBC细胞的增殖，迁移和侵袭能力，circ-EIF 6-ATG-mut组与对照组无显著差异。相应地，体内皮下成瘤实验表明circ-EIF6-OV促进了肿瘤细胞的增殖与转移能力。
(EIF6-224aa而非CIF-EIF6促进TNBC细胞的增殖和转移)
为进一步探索EIF6-224aa促肿瘤功能的分子机制，作者通过共免疫共沉淀技术以确定其与靶分子MYH9的相互作用，且二者共定位于细胞质中。将MYH9蛋白分段截短构建表达质粒，发现EIF6-224aa主要与MYH9的第一和第四片段相互作用。
其次使用蛋白合成抑制剂环己酰胺（CHX）处理，EIF6-224aa的过表达降低了MYH9的降解速度，也就是说circ-EIF6表达的内源性EIF6-224a保护MYH9免于降解。联合MG132蛋白酶体抑制剂和泛素化检测，结果表明EIF6-224aa过表达降低了MYH9蛋白的泛素化水平，保护MYH9蛋白免受蛋白酶体降解。
在EIF6-224aa-FLAG转染TNBC基础上加si-MYH9，一系列功能实验表明MYH9干扰拮抗了EIF6-224aa的致癌作用（对增殖，迁移和侵袭能力的影响）。
研究表明MYH9的表达与Wnt/β-catenin通路的激活相关，那么过表达EIF6-224aa后检测β-catenin表达上调，而用si-MYH9处理其表达下调。下游靶蛋白（cyclin D1、c-Myc、N-cad、E-cad和vimentin）的表达也发生了相应的变化。这些检测证实了Wnt/β-catenin通路中的靶基因被EIF6-224aa上调，而MYH9敲除则拮抗EIF6-224aa的作用。
(EIF6-224aa直接与MYH9相互作用 并保护其免受降解)
(EIF6-224aa通过激活 MYH9/Wnt/β-catenin途径促进TNBC进展)
综上，circ-EIF6通过编码新的多肽EIF6-224aa，进一步激活MYH9/Wnt/-连环蛋白通路，显著增强了TNBC细胞的增殖和转移。
此外，circ-EIF6是TNBC患者潜在的预后生物标志物。新发现的编码circ-EIF6拓宽了我们对TNBC的潜在机制的见解，并为TNBC患者的治疗提供了一个潜在的预后和治疗靶点。
(circ-EIF6调节TNBC增殖和转移的机制示意图)
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