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研究背景

啮齿动物和人类的数据都表明，肝脏中的sn-1,2-二酰基甘油(sn-1,2-DAG)作为第二信使直接过度激活蛋白激酶C(PKCε)，是导致肥胖相关脂质代谢紊乱的关键途径，可诱导肝胰岛素抵抗和2型糖尿病。在肝脏中DAG含量增加的物质中，sn-1,2-DAG是唯一能直接激活肝脏中PKCε的立体异构体。抑制sn-1,2-DAG-PKCε信号轴是治疗代谢性疾病的一种很有前途的策略。

文献来源

近日，中国药科大学天然药物活性组分与药效国家重点实验室李萍/杨华/郑祖国团队在Cell Metabolism发表题为“Discovery of a potent allosteric activator of DGKQ that ameliorates obesity-induced insulin resistance via the sn-1,2-DAG-PKCε signaling axis”的研究性论文，该研究利用高内涵筛选结合液质联用技术，筛选出中药活性成分白术内酯II(AT II)可降低肝脏sn-1,2-DAG水平，抑制PKCε活性，改善肥胖型胰岛素抵抗，并发现AT II的作用靶蛋白为DGKQ，深入的机制研究发现AT II别构激活DGKQ，且这一效应具有物种保守性。

AT II作为一种新型的肝脏sn-1,2-DAG抑制剂，抑制PKCε活性

首先使用荧光共振能量转移(FRET)探针，分别在PKCε的N端和C端使用CFP和YFP来监测PKCε的活性。利用高内涵技术建立PKCε抑制剂的高通量筛选体系，同时利用UPLC-TOF-MS分析，建立了一种降低细胞sn-1,2-DAG的活性化合物的筛选方法。结果表明，AT II作为一种新型的肝脏sn-1,2-DAG抑制剂，抑制 PKCε活性。

(图1 AT II作为sn-1,2-DAG-PKCε通路抑制剂的筛选和鉴定)

AT II通过胰岛素敏感的IRS1-PI3K-AKT通路抑制糖异生

为了进一步确证AT II药效作用，首先在细胞水平考察了AT II改善胰岛素抵抗的效应，结果显示AT II以剂量和时间依赖性的方式上调PA介导磷酸化，降低了PA诱导的糖异生酶的基因表达和糖异生基因表达，即AT II通过胰岛素敏感的IRS1-PI3K-AKT通路抑制糖异生。

(图2 AT II通过抑制糖异生和促进肝糖原合成来改善DIO小鼠的胰岛素抵抗)

AT II改善肥胖诱导的高脂血症、肝脂肪变性和胰岛素抵抗

接着利用长期高脂饮食(24周)、短期高脂饮食(1, 2, 4, 6周)和ob/ob小鼠诱导肥胖胰岛素抵抗模型，分别研究AT II的药理效力，急性毒性试验显示，小鼠的行为和生命体征无明显变化。药代动力学结果表明AT II主要在肝脏中富集，而不产生毒性。为确定AT II的潜在疗效，分别给予二甲双胍治疗，同时进行高胰岛素-正血糖钳夹研究，结果发现AT II治疗导致小鼠的肝脏、肌肉和脂肪组织的全身胰岛素敏感性。与上述结果一致，AT II还降低了肝脏sn-1、2-DAG水平。为进一步研究AT II影响能量消耗和体重的机制，使用Ucp1基因敲除小鼠进行验证发现UCP-1的表达在脂肪组织中受到AMPK-PGC1a通路的调控，它可以促进脂肪组织的褐变，增加能量消耗。结果发现AT II通过脂肪组织中的AMPK-PGC1a-UCP-1信号轴促进能量消耗和降低体重。综上结果表明AT II改善肥胖诱导的高脂血症、肝脂肪变性和胰岛素抵抗。

(图3 AT II通过抑制糖异生和增加肝糖原合成，改善ob/ob或DIO小鼠的胰岛素抵抗和肝脂肪变性)

AT II改善肥胖型胰岛素抵抗是依赖于肝脏sn-1,2-DAG-PKCε信号轴

研究发现，在过表达PKCε的肝细胞中，AT II不再增加被PA损伤的胰岛素敏感 AKT通路的活性，同时使用腺相关病毒(AAV)介导小鼠肝脏过表达PKCε，逆转了AT II对AKT活性的影响。

综合以上多种基因操控和药理学手段，在细胞水平和动物水平均验证AT II改善肥胖型胰岛素抵抗是依赖于肝脏sn-1,2-DAG-PKCε信号轴。

(图4 外源性过表达PKCε逆转了AT II对AT II治疗后胰岛素抵抗的影响)

AT II并不影响 DGKA、DGKE或DGKZ的活性，且AT II的三种衍生物对DGKQ没有产生任何激活作用

为了确定AT II的潜在靶点并进一步阐明抗代谢疾病作用的分子机制，设计并合成了保留AT II原活性的探针(A6)。为了探究AT II是否直接影响DGKQ的激活，文中建立了一种定量和非放射性的方法来测量DGKs的活性，发现AT II并不影响 DGKA、DGKE或DGKZ的活性，且AT II的三种衍生物对DGKQ没有产生任何激活作用。

(图5 DGKQ被确定为AT II的靶点)

AT II改善肥胖型胰岛素抵抗完全依赖于肝脏DGKQ

因此，利用化学蛋白质组学、MST、SPR、CETSA、DARTs、非放射性酶活检测等方法，确定AT II可特异性激活二酰甘油激酶θ(DGKQ)。进一步通过DGKQ抑制剂R59022以及DGKQ KO细胞，在细胞水平上证明了AT II通过激活DGKQ，从而抑制sn-1,2-DAG-PKCε信号轴，发挥改善胰岛素抵抗作用；通过建立肝脏特异性Dgkq敲降小鼠，在动物水平验证了AT II改善肥胖型胰岛素抵抗完全依赖于肝脏DGKQ。

(图6 AT II通过sn-1,2-DAG-PKCε通路对胰岛素抵抗的影响依赖于DGKQ)

AT II和肝脏Dgkq之间的直接相互作用介导了AT II的体内药理活性

最后为了深入探究AT II激活DGKQ的作用机制，研究构建了DGKQ不同结构域的重组蛋白，通过A6探针进行pull down实验，发现AT II可与DGKQ的CRD和PH结构域结合。通过同源建模、位点突变等，发现CRD结构域中的S193、C204和S241三个氨基酸位点在AT II和DGKQ的结合中起着决定性作用，而PH结构域中的A496、P497和H498三个氨基酸则可能是有助于AT II进入药物结合口袋。为了进一步探索Dgkq这种新型药物口袋在AT II体内疗效中的重要性，作者通过AAV介导表达Dgkq野生型或Mut6突变体，恢复了肝脏中的Dgkq水平。其结果共同支持了AT II和肝脏Dgkq之间的直接相互作用介导了AT II的体内药理活性的假说。